[发明专利]浙江雪胆雌、雄株的组培快速繁殖方法

权利要求书

1.浙江雪胆的组培快速繁殖方法，其特征在于利用已知性别的浙江雪胆雌、雄株的茎段作为外植体，依次进行以下步骤：

1）、取材：

于5～6月开花期，分别选择浙江雪胆的雌株和雄株的块茎进行种植，直至块茎上抽出新的茎段；

2）、茎段的消毒：

当步骤1）所得的茎段为只带有1～2个节的短茎段时，直接取用该短茎段；

当步骤1）所得的茎段为带有＞2个节的长茎段时，将长茎段分割成带有1～2个节的短茎段；

将所述短茎段进行清洗和灭菌，得消毒后茎段；

3）、腋芽的启动培养：

将消毒后茎段按照形态学的上端朝上、下端朝下插入到启动培养基上，进行腋芽的诱导；

所述启动培养基为MS+ BA 0.5～2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.9～7.0 g/L，pH5.8～6.0；

诱导培养条件为：于22~26℃进行光/暗交替培养；

当启动培养基上的茎段的腋芽萌发伸长至4～6 cm时，结束启动培养；

4）、无菌苗茎段的增殖培养/快速扩增：

将步骤3）所得的腋芽切成带1~2个节的茎段，转接于增殖培养基上进行培养，

增殖培养基为改良MS+BA 0.5 mg/L +蔗糖 30 g/L+琼脂7.2～7.3 g/L，pH为5.8～6.0；

或者，增殖培养基为改良MS+ BA 0.5 mg/L+ NAA 0.05 mg/L +蔗糖 30 g/L+琼脂7.2～7.3 g/L，pH为5.8～6.0；

增殖培养条件为：于22~26℃进行光/暗交替培养；

待增殖培养基上的茎段的腋芽萌发伸长生长为带有3-5个节，且节上具有鸟足状复叶时，结束培养，得无菌苗；

5）、叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化培养：

取步骤4）所得的鸟足状复叶，在鸟足状复叶的每个小叶片的主脉及叶柄上间隔3～5mm 切割一次，然后接种到愈伤组织诱导/不定芽分化培养基上进行诱导；

所述愈伤组织诱导/不定芽分化培养基为以下任一：

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅰ为含B5有机物的MS+NAA 0.75 mg/L+ BA 0.45 mg/L+ 30 g/L 蔗糖+ 琼脂6.9～7.0 g/L , pH 5.8～6.0；

愈伤组织诱导/不定芽分化培养基Ⅱ为含B5有机物的MS+BA 1 mg/L + ZT 0.5 mg/L +GA₃ 0.5 mg/L+ 30g/L 蔗糖+ 琼脂6.9～7.0 g/L, pH 5.8～6.0；

含B5有机物的MS为在1 L的MS基本培养基加入烟酸 1.0 mg、盐酸吡哆醇 1.0 mg、和盐酸硫铵素10 mg

诱导条件为：先于22～24℃暗培养2周，然后转入22~26℃进行光/暗交替培养；小叶片切口处形成愈伤组织，当此愈伤组织上分化获得高度为4～6 cm的不定芽时，结束诱导培养；

6）、生根培养：

将步骤4）所得的无菌苗，或者步骤5）所得的不定芽转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为：先于22～24℃暗培养2～3天，然后转入22~26℃进行光/暗交替培养；当无菌苗/不定芽的基部产生长度≥3cm的6～10条根时结束生根培养；

所述生根培养基为以下任意一种：

改良MS+ IBA 0.2～0.4 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 琼脂7.2～7.3 g/L，pH 5.8～6.0，

改良MS+ NAA 0.02～0.04 mg/L+蔗糖 20 g/L+ 琼脂7.2～7.3 g/L，pH 5.8～6.0；

7）、移栽：

将步骤6）所得的生根幼苗取出后，进行移栽；

改良MS培养基为：硝酸铵825 mg/L， 硝酸钾950 mg/L ，氯化钙440 mg/L，磷酸二氢钾340 mg/L，硫酸镁370 mg/L， 硫酸亚铁55.6 mg/L，乙二胺四乙酸二钠74.6 mg/L ，碘化钾0.83 mg/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸锰22.3 mg/L，硫酸锌8.6 mg/L，钼酸钠0.25 mg/L，硫酸铜0.025 mg/L，氯化钴0.025 mg/L，肌醇 100 mg/L，烟酸 1.0 mg/L，盐酸吡哆醇 1.0 mg/L，盐酸硫铵素10 mg/L；余量为去离子水。