[发明专利]一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法在审
| 申请号： | 201910559279.X | 申请日： | 2019-06-26 |
| 公开（公告）号： | CN110257416A | 公开（公告）日： | 2019-09-20 |
| 发明（设计）人： | 高士刚;戴富明;曾蓉;徐丽慧;王良军;杨晓峰 | 申请（专利权）人： | 上海润庄农业科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/80 | 分类号： | C12N15/80;C12R1/645 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 201415 上海*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明提出了一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；(4)制备阳性农杆菌转化子菌液；(5)混合菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选。本发明的方法转化效率高，操作简单。 | ||
| 搜索关键词： | 主棒 农杆菌转化子 高效遗传转化 农杆菌介导 制备 利福平 感受态细胞 阳性转化子 乙酰丁香酮 孢子悬浮液 混合菌液 卡那霉素 抗性筛选 双元载体 转化效率 培养基 单菌落 农杆菌 孵育 活化 菌液 筛选 转化 | ||
【主权项】：
1.一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，包括：(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；(4)取步骤(3)中培养后的菌液，离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤所述菌体，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD600＝0.2～0.25；之后震荡培养使OD600在0.6～0.8，即为阳性农杆菌转化子菌液；(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选：将步骤(5)在选择性CYA培养基上进行抗性筛选，暗箱培养直至出现明显的单菌落，即为候选转化子；所述选择性CYA培养基含有头孢和潮霉素；将所述候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA培养基上培养并产生分生孢子；制备分生孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子。
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