[发明专利]一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法

说明书

本发明提出了一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；(4)制备阳性农杆菌转化子菌液；(5)混合菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选。本发明的方法转化效率高，操作简单。

技术领域

本发明涉及遗传转化领域，特别是指一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法。

背景技术

多主棒孢(Corynespora cassiicola(Berk.&Curt.)Wei.)属半知菌亚门棒孢菌属丝状真菌，可侵染黄瓜、番茄、烟草、橡胶、棉花等500多种蔬菜和经济作物，引起叶斑病，每年发生面积超过66.7万公顷，损失超过50亿。致病相关基因的鉴定、克隆和功能分析将有助于揭示该病菌致病的分子机理以及病害的有效防控。目前，可采用PEG介导的原生质体遗传转化方法研究病菌的基因功能。

然而，一方面，PEG介导的原生质体遗传转化方法转化效率低；另一方面，该方法对原生质的质量要求较高，限制了该方法在多主棒孢致病相关基因功能研究上的应用。

有鉴于此，有必要研发一种多主棒孢高效遗传转化方法。

发明内容

本发明提出一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，解决了现有技术中PEG介导的原生质体遗传转化方法转化效率低的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，包括：

(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；

(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；

(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；

(4)取步骤(3)中培养后的菌液，离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤所述菌体，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD6₀₀＝0.2～0.25；之后震荡培养使OD₆₀₀在0.6～0.8，即为即为阳性农杆菌转化子菌液；

(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；

(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选：将步骤(5)在选择性CYA培养基上进行抗性筛选，暗箱培养直至出现明显的单菌落，即为候选转化子；所述选择性CYA培养基含有头孢和潮霉素；将所述候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA培养基上培养并产生分生孢子；制备分生孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子。

作为优选的技术方案，所述多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤如下：

多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA培养基上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；在PDA培养基中加入ddH₂O，用毛笔将孢子洗下来，再用无菌纱布过滤；室温离心收集孢子，用ddH₂O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×10⁵CFU/mL。

作为优选的技术方案，所述LB液体培养基中含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素。

作为优选的技术方案，所述阳性农杆菌转化子的活化条件为：