[发明专利]一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，包括：

(1)多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤；

(2)双元载体pCAMBIA1300转化农杆菌AGL1感受态细胞；筛选、鉴定阳性农杆菌转化子；

(3)活化上述阳性农杆菌转化子，然后将单菌落转到含利福平和卡那霉素的LB液体培养基中培养；

(4)取步骤(3)中培养后的菌液，离心收集菌体；用含有乙酰丁香酮的IM培养基洗涤所述菌体，然后再用含有乙酰丁香酮的IM培养基重悬该菌体，将菌体浓度稀释至OD6₀₀＝0.2～0.25；之后震荡培养使OD₆₀₀在0.6～0.8，即为阳性农杆菌转化子菌液；

(5)混合步骤(1)制备的多主棒孢孢子悬浮液与步骤(4)制备的阳性农杆菌转化子菌液，并进行孵育；之后在含有乙酰丁香酮的IM培养基中培养；

(6)多主棒孢阳性转化子的抗性筛选：将步骤(5)在选择性CYA培养基上进行抗性筛选，暗箱培养直至出现明显的单菌落，即为候选转化子；所述选择性CYA培养基含有头孢和潮霉素；将所述候选转化子连续在含头孢的CYA培养基上传5代后，接种于PDA培养基上培养并产生分生孢子；制备分生孢子悬浮液并涂布于含潮霉素的选择性PDA培养基上，进一步筛选稳定遗传的多主棒孢阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述多主棒孢孢子悬浮液的制备步骤如下：

多主棒孢菌(HG20101029-1)在PDA培养基上25℃培养10d，每天交替进行12h光照、12h黑暗；在PDA培养基中加入ddH₂O，用毛笔将孢子洗下来，再用无菌纱布过滤；室温离心收集孢子，用ddH₂O重悬孢子，将孢子悬浮液的孢子浓度调成2×10⁵CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基中含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述阳性农杆菌转化子的活化条件为：

在含100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的LB平板上28℃活化2d。

5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基的培养条件为：28℃，200rpm～250rpm振荡培养25～30小时。

6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(5)中的多主棒孢孢子悬浮液与阳性农杆菌转化子菌液以体积比1～1.5:1～1.5混合。

7.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述孵育的条件为28℃，时间为0.5～1小时。

8.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述选择性CYA培养基中含有200μg/mL头孢和100μg/mL潮霉素。

9.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的多主棒孢高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(6)中的多主棒孢阳性转化子还包括鉴定的步骤：提取所述阳性转化子DNA，扩增潮霉素编码基因hph验证阳性转化子。