[发明专利]携带2型BVDV-Erns

摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种携带2型BVDV‑Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。本发明利用分子克隆及反向遗传方法，将BVDV2‑890#毒株的Erns基因和CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1区置换CSFV‑C株相应的基因片段，并引入7个特定的突变位点，得到了重组病毒rC‑Marker2。获得的重组病毒带有分子标记(BVDV2 Erns)，猪瘟病毒2型流行毒株的VR1以及特定的突变位点，为开发适应体外细胞培养体系的标记疫苗奠定了基础。应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够通过血清学方法判断猪瘟病毒抗体阳性的猪是由于疫苗接种还是野毒感染引起；对当前流行的基因2型猪瘟病毒有较好的中和效果；在体外细胞培养系统中表现出良好的生长能力，可以降低疫苗的生产成本。

主权项

1.一种携带2型BVDV‑E^rns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将GenBank登录号为NC_039237.1的人工合成的BVDV2型毒株890#E^rns基因序列并克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57‑B1E^rns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其E^rns基因片段；(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV2‑890#株E^rns基因片段克隆至CSFV‑C株感染性克隆质粒pA‑FL22，置换CSFV基因组的E^rns片段，得到携带BVDV2型E^rns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV‑C‑B2E^rns；(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14的基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7‑126nt片段；(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1序列克隆至步骤(2)所获得pCSFV‑C‑B2E^rns中，置换CSFV基因组E2基因的VR1片段，得到携带BVDV2型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV‑C‑B2E^rns‑VR1；(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将重组病毒基因组上3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位的核苷酸进行突变，得到携带BVDV2型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV‑Cm7‑B2E^rns‑VR1；所述的突变结果为：T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；(6)将步骤(5)得到的pCSFV‑Cm7‑B2E^rns‑VR1通过酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒基因组RNA；(7)将步骤(6)得到的基因组RNA通过电转导入猪肾细胞PK‑15中，经过连续传代得到携带BVDV2型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV病毒Cmut7‑B2E^rns‑VR1。