[发明专利]携带2型BVDV-Erns

权利要求书

1.一种携带2型BVDV-E^rns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将GenBank登录号为NC_039237.1的BVDV2型毒株890#E^rns基因序列进行人工合成，并克隆于pUC57，得到重组质粒pUC57-B2E^rns；以该重组质粒为模板，PCR扩增其E^rns基因片段；

(2)通过一步定向克隆法，将步骤(1)获得的BVDV2-890#株E^rns基因片段克隆至CSFV-C株感染性克隆重组质粒pA-FL22，置换CSFV基因组的E^rns片段，得到携带BVDV2型E^rns基因的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B2E^rns；

(3)以CSFV基因2型流行毒株QZ14的基因组cDNA为模板，PCR扩增其E2基因的VR1区7-126nt片段即VR1片段；所用CSFV流行毒株E2的VR1片段序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)通过一步定向克隆法，将步骤(3)所获QZ14株的VR1片段克隆至步骤(2)所获得pCSFV-C-B2E^rns中，置换CSFV基因组E2基因的VR1片段，得到携带BVDV2型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段的重组CSFV感染性克隆pCSFV-C-B2E^rns-VR1；

(5)用带有突变位点的引物，结合一步定向克隆法，将重组病毒基因组上3310位、3433位、3531位、4085位、8286位、10332位和11836位的核苷酸进行突变，得到携带BVDV2型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV感染性克隆pCSFV-Cm7-B2E^rns-VR1；所述的突变结果为：T3310G、C3433T、G3531T、A4085G、C8286A、A10332G和A11836C，相对应的氨基酸变化为：M979R、A1020V、V1053L、I1237M、L2638I、S3320G和K3821T；

(6)将步骤(5)得到的pCSFV-Cm7-B2E^rns-VR1通过酶切线性化，体外转录得到重组嵌合CSFV病毒基因组RNA；

(7)将步骤(6)得到的基因组RNA通过电转导入猪肾细胞PK-15中，经过连续传代得到携带BVDV2型E^rns基因和CSFV流行毒株VR1片段以及7个特定突变位点的重组CSFV病毒Cmut7-B2E^rns-VR1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；步骤(2)中所用的引物序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；步骤(3)中所用的引物序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.7所示；步骤(4)中所用的引物序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9所示；步骤(5)中所用的引物序列如SEQ ID NO.10～SEQ IDNO.23所示。