[发明专利]携带2型BVDV-Erns

说明书

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种携带2型BVDV‑Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。本发明利用分子克隆及反向遗传方法，将BVDV2‑890#毒株的E^rns基因和CSFV流行毒株QZ14的E2基因VR1区置换CSFV‑C株相应的基因片段，并引入7个特定的突变位点，得到了重组病毒rC‑Marker2。获得的重组病毒带有分子标记(BVDV2 E^rns)，猪瘟病毒2型流行毒株的VR1以及特定的突变位点，为开发适应体外细胞培养体系的标记疫苗奠定了基础。应用该技术构建的重组嵌合猪瘟病毒弱毒标记疫苗株，能够通过血清学方法判断猪瘟病毒抗体阳性的猪是由于疫苗接种还是野毒感染引起；对当前流行的基因2型猪瘟病毒有较好的中和效果；在体外细胞培养系统中表现出良好的生长能力，可以降低疫苗的生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种携带2型牛病毒性腹泻病毒Erns基因的高繁殖力猪瘟弱毒标记疫苗的构建方法。

背景技术

猪瘟是我国规定的必须通报的一类传染病，严重威胁养猪业的健康发展。猪瘟是一种高度接触传染性、致死性疫病。急性猪瘟表现为病程短、高热稽留、全身泛发性点状出血及脾梗死等。慢性猪瘟多表现为仔猪发育迟缓，母猪流产、死胎、产弱子，剖检可见回盲肠袢出现纽扣状溃疡等。猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起，CSFV因为疫苗免疫压力下不断演化，导致该病毒仍在东欧、亚洲、拉丁美洲等地区流行。猪瘟病毒呈二十面体结构，直径约40-60nm。由最核心的基因组，包裹基因组的衣壳蛋白及外层的囊膜构成。在囊膜上存在三种囊膜糖蛋白，分别为E^rns、E1和E2。其中E^rns和E2具有诱导中和抗体的能力，可保护猪只免受致死性强毒的攻击。

猪瘟兔化弱毒C株是我国科学家于上世纪50年代研制出的针对猪瘟病毒的疫苗。该疫苗遗传稳定，免疫效果好且对猪只安全，是国内外公认的安全有效的疫苗。但由于它是由猪瘟强毒在兔体内长期传代获得，其细胞嗜性发生改变，导致其在用猪细胞系培养时不能产生较高的滴度，在一定程度上制约了C株细胞苗的生产效率和效益。浙江大学研究小组在前期试验中发现，向C株基因组引入8个特定的突变位点，可显著提高其在猪细胞系中的繁殖能力。

CSFV只有一个血清型，但由于病毒的不断演化，目前根据E2蛋白的编码序列可将其分为三个基因型，分别为基因1型、2型和3型。猪瘟兔化弱毒C株属于基因1型。近几十年来，在疫苗的免疫压力下，猪瘟流行毒株出现了从引起急性猪瘟的基因1型向温和型的基因2型演化的趋势。C株免疫血清虽对基因2型流行毒株有中和能力，但相比对传统的基因1型毒株，其对2型流行毒株的中和能力已明显减弱。这就导致部分养殖场虽免疫了C株，但猪群中依然存在隐性带毒或出现非典型猪瘟的现象，这也是CSFV难以被净化的一个重要原因。浙江大学研究小组在对E2蛋白抗原表位的分析中发现，E2蛋白的抗原表位存在三个高变区(Hypervariable Antigenic Region)，分别为VR1(aa702-731)、VR2(aa774-799)和VR3(aa841-864)。其中将C株E2的VR1置换为2型毒株的VR1后，嵌合病毒诱导的血清对2型流行毒株的中和能力显著提高。

目前我国对猪瘟的防控是采取C株疫苗免疫。C株虽有良好的免疫效果，但无法通过血清学的方法来判定CSFV抗体阳性血清是由于疫苗免疫还是野毒感染引起，这就对猪瘟的快速诊断及净化造成困扰。因此，改造及开发具有鉴别诊断能力的新型猪瘟弱毒疫苗对猪瘟的防控及净化具有重要意义。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒同属黄病毒科瘟病毒属成员，其囊膜糖蛋白与猪瘟病毒的囊膜糖蛋白有较高相似度，但又有所区别。近十几年，欧盟多个实验室联合开发出以BVDV CP7株为骨架嵌合猪瘟病毒Alfort-187株E2蛋白的嵌合病毒疫苗CP7-E2alf，并开发出配套的检测体系。但是，由于该病毒骨架为BVDV，且嵌合的猪瘟病毒片段来自欧洲曾经流行的强毒株Alfort-187，若引入可能会有一定的生物安全隐患。因此，开发适合我国猪瘟防控的新型标记弱毒疫苗势在必行。

发明内容