[发明专利]一种幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法

摘要

本发明公开了一种幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法，包括目的蛋白表达载体的构建、目的蛋白在优化条件下的诱导表达、目的蛋白的分离纯化等步骤。本发明通过构建含有His标签的目的蛋白表达载体，并成功转入宿主菌；同时通过设计正交试验对影响工程菌菌体生长和目的蛋白诱导表达量的预诱导时间、诱导温度、诱导剂终浓度和诱导时间这四个因素进行了优化，得到最佳诱导表达条件，使目的蛋白的表达量大大提高；还优化了目的蛋白的亲和层析方法和洗脱体系，使目的蛋白的纯度达98％，比传统方法得到显著提升，对于规模化大量生产重组蛋白具有很好的应用前景。

主权项

1.一种幽门螺杆菌重组丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.对重组载体pET‑22b‑HtrA的HtrA基因片段进行基因C末端的定点突变，然后在基因片段的C末端添加6×His标签，得含有组氨酸标签的重组丝氨酸蛋白酶基因片段HtrA‑His；将目的蛋白编码基因序列插入重组载体pET‑22b‑HtrA的多克隆位点酶切位点5’Nde I和3’Sal I之间，得目的蛋白表达载体pET‑22b‑HtrA‑His；再将成功连接的pET‑22b‑HtrA‑His导入宿主细胞E.coil BL21中，即获得含有重组载体pET‑22b‑HtrA‑His的E.coil BL21工程菌；S2.在优化表达条件下培养转化的宿主菌，实现融合蛋白可溶性表达；所述优化条件为：以IPTG为诱导物对宿主菌进行诱导表达，诱导浓度为125～500μmol/L，诱导温度为28～37℃，预诱导表达时间为2～4h，诱导表达时间为3～7h；S3.收集步骤S2所得诱导后的宿主菌并经反复冻融进行裂解；充分裂解后，离心并弃去沉淀，收集上清，得粗蛋白液；S4.采用镍亲和层析法分离目的融合蛋白，先用含2mM咪唑的缓冲液体系冲洗去除非特异性结合的杂蛋白，再在含50mM咪唑的缓冲液体系条件下洗脱获得目的蛋白，再以300mM为高浓度咪唑洗脱去除未冲洗干净的与填料结合蛋白，收集50mM咪唑洗脱液，即得融合的目的蛋白。