[发明专利]一种幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法

说明书

本发明公开了一种幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法，包括目的蛋白表达载体的构建、目的蛋白在优化条件下的诱导表达、目的蛋白的分离纯化等步骤。本发明通过构建含有His标签的目的蛋白表达载体，并成功转入宿主菌；同时通过设计正交试验对影响工程菌菌体生长和目的蛋白诱导表达量的预诱导时间、诱导温度、诱导剂终浓度和诱导时间这四个因素进行了优化，得到最佳诱导表达条件，使目的蛋白的表达量大大提高；还优化了目的蛋白的亲和层析方法和洗脱体系，使目的蛋白的纯度达98％，比传统方法得到显著提升，对于规模化大量生产重组蛋白具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)能够感染胃部组织并且引发溃疡，是胃溃疡和胃癌的致病因子。幽门螺杆菌的感染通常发生于幼年时期，该菌分布广泛，很多人都是该菌的携带者，其引发的并发症包括胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡。此外，该菌也会增加携带者患胃癌的风险。

目前，胃炎和胃溃疡可利用抗生素加以治疗，这些治疗经常需要使用2～3种不同类型的抗生素，却仍不能够治愈所有的病人。当前尚无能有效地治疗胃癌的方法，且抗生素耐药性的不断扩散也使得治疗这种细菌感染变得更加复杂。通过研究幽门螺杆菌引发胃癌的机制，有可能找到治疗胃癌的新途径。

近年来有研究人员发现幽门螺杆菌能分泌一种被称作HtrA的丝氨酸蛋白酶，HtrA能切割三种蛋白：闭合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白-8(claudin-8)和胃上皮钙黏蛋白(E-cadherin)，从而破坏上皮细胞保护层。因此，幽门螺杆菌能通过分泌丝氨酸蛋白酶来侵入更深的、通常不含病原体的组织层中，从而造成进一步的损伤。

因此，表达纯化出幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶，可以为后续获得相应的抗幽门螺杆菌抗体奠定坚实的基础。而获得的抗体可通过抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的活性，从而阻断幽门螺杆菌感染人体的途径，从而对其导致的相关疾病产生预防和治疗作用。中国专利CN108531468A公开了一种编码重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的基因、卵黄抗体与应用，通过基因合成，得到编码重组丝氨酸蛋白酶的基因；将其原核表达，纯化，获得重组丝氨酸蛋白酶，将重组丝氨酸蛋白酶作为免疫抗原免疫母鸡，收集免疫后的母鸡产下的鸡蛋，提取鸡蛋中的卵黄抗体，纯化，得到抑制幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的卵黄抗体，该卵黄抗体可以作为食品添加剂或加入保健品中，也可以进一步制成药品用于预防或治疗胃溃疡和胃癌。虽然该专利在一定程度上提高了重组丝氨酸蛋白酶的表达量且为可溶性表达(70～85％的重组幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶以可溶性形式蛋白表达)，但还有进一步提升的空间。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种幽门螺杆菌重组丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法，本发明通过构建含有His标签的目的蛋白表达载体，并成功转入宿主菌；同时通过设计正交试验对影响工程菌菌体生长和目的蛋白诱导表达量的预诱导时间、诱导温度、诱导剂终浓度和诱导时间这四个因素进行了优化，得到最佳诱导表达条件，使目的蛋白的表达量大大提高；还优化了目的蛋白的亲和层析方法和洗脱体系，使目的蛋白的纯度达98％，比传统方法得到显著提升。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种幽门螺杆菌重组丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法，包括如下步骤：

S1.对重组载体pET-22b-HtrA的HtrA基因片段进行基因C末端的定点突变，然后在基因片段的C末端添加6×His标签，得含有组氨酸标签的重组丝氨酸蛋白酶基因片段HtrA-His；将目的蛋白编码基因序列插入重组载体pET-22b-HtrA的多克隆位点酶切位点5’Nde I和3’Sal I之间，得目的蛋白表达载体pET-22b-HtrA-His；再将成功连接的pET-22b-HtrA-His导入宿主细胞E.coil BL21中，即获得含有重组载体pET-22b-HtrA-His的E.coil BL21工程菌；