[发明专利]一种幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法在审
| 申请号： | 201910356684.1 | 申请日： | 2019-04-29 |
| 公开（公告）号： | CN110042093A | 公开（公告）日： | 2019-07-23 |
| 发明（设计）人： | 赵肃清;王甜甜;肖益热;陈莉莉;叶远志 | 申请（专利权）人： | 广东工业大学 |
| 主分类号： | C12N9/52 | 分类号： | C12N9/52;C12N15/57;C12N15/70 |
| 代理公司： | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人： | 林丽明 |
| 地址： | 510006 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 目的蛋白 丝氨酸蛋白酶 诱导 幽门螺杆菌 表达载体 诱导表达 优化 构建 诱导表达条件 分离纯化 亲和层析 影响工程 优化条件 正交试验 重组蛋白 表达量 规模化 菌菌体 宿主菌 诱导剂 洗脱 转入 生长 应用 成功 | ||
1.一种幽门螺杆菌重组丝氨酸蛋白酶的表达优化及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.对重组载体pET-22b-HtrA的HtrA基因片段进行基因C末端的定点突变，然后在基因片段的C末端添加6×His标签，得含有组氨酸标签的重组丝氨酸蛋白酶基因片段HtrA-His；将目的蛋白编码基因序列插入重组载体pET-22b-HtrA的多克隆位点酶切位点5’Nde I和3’Sal I之间，得目的蛋白表达载体pET-22b-HtrA-His；再将成功连接的pET-22b-HtrA-His导入宿主细胞E.coil BL21中，即获得含有重组载体pET-22b-HtrA-His的E.coil BL21工程菌；
S2.在优化表达条件下培养转化的宿主菌，实现融合蛋白可溶性表达；所述优化条件为：以IPTG为诱导物对宿主菌进行诱导表达，诱导浓度为125～500μmol/L，诱导温度为28～37℃，预诱导表达时间为2～4h，诱导表达时间为3～7h；
S3.收集步骤S2所得诱导后的宿主菌并经反复冻融进行裂解；充分裂解后，离心并弃去沉淀，收集上清，得粗蛋白液；
S4.采用镍亲和层析法分离目的融合蛋白，先用含2mM咪唑的缓冲液体系冲洗去除非特异性结合的杂蛋白，再在含50mM咪唑的缓冲液体系条件下洗脱获得目的蛋白，再以300mM为高浓度咪唑洗脱去除未冲洗干净的与填料结合蛋白，收集50mM咪唑洗脱液，即得融合的目的蛋白。
2.根据权利要求1所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述IPTG的诱导浓度为200～300μmol/L。
3.根据权利要求2所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述IPTG的诱导浓度为200μmol/L。
4.根据权利要求1所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导温度为35～37℃。
5.根据权利要求4所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导温度为37℃。
6.根据权利要求1所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述预诱导表达时间为3～4h。
7.根据权利要求1所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述预诱导表达时间为4h。
8.根据权利要求1所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导表达时间为4～6h。
9.根据权利要求1所述表达优化及纯化方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导表达时间为5h。
10.权利要求1至9任一项所述表达优化及纯化方法在表达纯化生物大分子目的蛋白中的应用。
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