[发明专利]一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法

摘要

本发明属于基因纯化检测技术领域，具体涉及一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法。本发明采用柱式离心管吸附对粪便上清中的基因组进行提取，操作简便快速，最大可提取20g的粪便，显著提高粪便总基因组得率，且人基因组占比显著高于现有的方法和成品试剂盒，采用本发明方法提取纯化得到的基因组纯度高，质量稳定。

主权项

1.一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)取出已装入粪便样本的粪便保存管，粪便样本和保存液混匀后至少保存4h；(2)将粪便保存管放入离心机中离心取2～6mL上清，离心速度为2000‑5000rpm，离心时间为5‑10min，将上清转移至新的离心管中；(3)在步骤(2)最终得到的上清中加入色素吸附沉淀剂，在30‑40℃的条件下孵育处理10‑20min，期间混匀数次；所述的色素吸附沉淀剂采用硫酸铵和氯化钙、硫酸铝铵和醋酸铵、纤维素、PVPP或PVP10中的一组多个组合联合；(4)孵育完成后，离心取上清，离心速度为5000‑8000rpm，离心时间5‑10min，选择性再次离心取上清，离心速度为10000‑14000rpm，离心时间3‑5min；(5)取步骤(4)最终得到的上清1‑4mL 25‑40℃条件下进行RNA消化，RNaseA用量为2‑5mg，消化时间为10‑20min；(6)RNA消化结束后，加入4‑8mg蛋白酶K进行蛋白质消化，加入0.5‑1倍上清体积的缓冲液BS，55‑65℃条件下进行消化，消化时间为10‑20min，孵育结束后，冷却至室温，3000‑5000rpm离心3‑5min，取上清；所述的缓冲液BS的配方成分及浓度为：EDTA 50mM，NaCl 500mM，十二磺基硫酸钠1％，盐酸胍，pH 8.0；(7)加入0.5‑1倍步骤(6)中上清体积的无水乙醇，颠倒混匀5‑10次，将混合液转移至吸附柱中，4000‑5000rpm离心1‑3min，取上清；(8)向步骤(7)得到的上清中加入洗涤液WB1 2mL，进行离心，离心速度4000‑5000rpm，离心1‑3min，离心结束后，倒去流出液，加入洗涤液WB2 2mL，进行离心，离心速度4000‑5000rpm，离心1‑3min，离心结束后，倒去流出液，重复洗涤1‑3次，洗涤结束后，吸附柱室温干燥3‑5min；所述的洗涤液WB1的配方成分及浓度为：盐酸胍1M，醋酸钠0.5M，无水乙醇30％；(9)吸附柱加入200‑500μL洗脱液EB洗脱核酸，室温放置5‑10min，使核酸充分的从吸附膜上剥离，进行离心，离心速度4000‑5000rpm，离心1‑3min；所述的洗脱液EB包含Tris‑HCl成分，浓度为10mM，pH8.0；所述的洗涤液WB2的配方成分及浓度为：无水乙醇75％；(10)采用核酸纯化试剂盒进一步纯化离心后的核酸，得到纯化后的核酸。(11)采用酶标仪对纯化后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定，采用Q‑PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定。