[发明专利]一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法

说明书

本发明属于基因纯化检测技术领域，具体涉及一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法。本发明采用柱式离心管吸附对粪便上清中的基因组进行提取，操作简便快速，最大可提取20g的粪便，显著提高粪便总基因组得率，且人基因组占比显著高于现有的方法和成品试剂盒，采用本发明方法提取纯化得到的基因组纯度高，质量稳定。

技术领域

本发明属于基因纯化检测技术领域，具体涉及一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法。

背景技术

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率高，且呈逐年上升的趋势。结直肠癌早期常无明显临床症状，就诊时大部分患者已进展为中晚期，所以早期诊断对于降低结直肠癌的发病率和致死率起到关键作用。

常用的结直肠癌早期诊断的方法有结肠镜检测、大便隐血检测、粪便RNA检测和粪便DNA检测等。结肠镜检测是诊断结直肠癌的常规方法，但是该方法具有侵入性，肠道穿孔风险高，且检测前需要肠道准备，操作繁琐。大便隐血检测虽为非侵入性检测，但检测前需控制饮食，且检测灵敏度低，特异性差，易出现误诊。粪便RNA检测和粪便DNA检测同为无创检测技术，由于粪便中人类核酸全部来自于肠壁脱落细胞，能够直观反映肠壁组织异常情况，因此极大的提高了检测特异性。然而，粪便RNA提取困难，操作繁琐，检测成功率低。粪便DNA检测无疑成为结直肠癌无创诊断的最佳手段。

粪便DNA大多来源于肠道细菌，人基因组含量很少。且粪便成分复杂，其中大量多糖、胆酸等成分会对下游反应产生抑制。目前，粪便人基因组的提取方法分为两类：直接提取粪便人基因组和富集肠壁脱落细胞后提取人基因组。

直接提取法可以同时提取到肠壁脱落细胞和散落在粪便中的人基因组，因此DNA损失少，产率高，适合应用于对DNA模板数量要求高的下游检测。主要包括三种方法：柱式离心管吸附提取法、磁珠捕获法和电泳捕获法。

富集肠壁脱落细胞后提取人基因组，能够保证提取的DNA全部来源于肠壁脱落细胞，特异性好，提取DNA产物浓度高，且粪便中的抑制成分去除彻底。但该方法只能提取到未凋亡脱落细胞中的DNA，而散落在粪便中的人基因组被遗失，且提取过程细胞损失大，故产率低，该方法适用于对提取产物纯度要求高的下游检测。主要包括三种方法：离心淘洗法、密度梯度离心法和免疫磁珠法。

目前常见的提取方法是先对粪便中的脱落细胞进行保存，在处理过程中先离心取沉淀，随后对沉淀进行裂解释放核酸，这种处理方式会使得得到的基因组DNA中，菌基因组DNA比例较高，人基因组含量在总基因组含量中的占比较低，且杂质不易去除，在后续采用硅胶膜纯化时，容易造成堵塞。大多数提取方法和成品试剂盒都是针对粪便中的菌基因组提取。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，本发明采用柱式离心管吸附对粪便上清中的基因组进行提取，操作简便快速，最大可提取20g的粪便，显著提高粪便总基因组得率，且人基因组占比显著高于现有的方法和成品试剂盒，采用本发明方法提取纯化得到的基因组纯度高，质量稳定。

本发明的粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，按照以下步骤进行：

(1)取出已装入粪便样本的粪便保存管，粪便样本和保存液混匀后至少保存4h；

(2)将粪便保存管放入离心机中离心取2～6mL上清，离心速度为2000-5000rpm，离心时间为5-10min，将上清转移至新的离心管中；

(3)在步骤(2)最终得到的上清中加入色素吸附沉淀剂，在30-40℃的条件下孵育处理10-20min，期间混匀数次；

(4)孵育完成后，离心取上清，离心速度为5000-8000rpm，离心时间5-10min，选择性再次离心取上清，离心速度为10000-14000rpm，离心时间3-5min；