[发明专利]一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法

权利要求书

1.一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)取出已装入粪便样本的粪便保存管，粪便样本和保存液混匀后至少保存4h；

(2)将粪便保存管放入离心机中离心取2～6mL上清，离心速度为2000-5000rpm，离心时间为5-10min，将上清转移至新的离心管中；

(3)在步骤(2)最终得到的上清中加入色素吸附沉淀剂，在30-40℃的条件下孵育处理10-20min，期间混匀数次；所述的色素吸附沉淀剂采用硫酸铵和氯化钙、硫酸铝铵和醋酸铵、纤维素、PVPP或PVP10中的一组多个组合联合；

(4)孵育完成后，离心取上清，离心速度为5000-8000rpm，离心时间5-10min，选择性再次离心取上清，离心速度为10000-14000rpm，离心时间3-5min；

(5)取步骤(4)最终得到的上清1-4mL 25-40℃条件下进行RNA消化，RNaseA用量为2-5mg，消化时间为10-20min；

(6)RNA消化结束后，加入4-8mg蛋白酶K进行蛋白质消化，加入0.5-1倍上清体积的缓冲液BS，55-65℃条件下进行消化，消化时间为10-20min，孵育结束后，冷却至室温，3000-5000rpm离心3-5min，取上清；所述的缓冲液BS的配方成分及浓度为：EDTA 50mM，NaCl500mM，十二磺基硫酸钠1％，盐酸胍，pH 8.0；

(7)加入0.5-1倍步骤(6)中上清体积的无水乙醇，颠倒混匀5-10次，将混合液转移至吸附柱中，4000-5000rpm离心1-3min，取上清；

(8)向步骤(7)得到的上清中加入洗涤液WB1 2mL，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min，离心结束后，倒去流出液，加入洗涤液WB2 2mL，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min，离心结束后，倒去流出液，重复洗涤1-3次，洗涤结束后，吸附柱室温干燥3-5min；所述的洗涤液WB1的配方成分及浓度为：盐酸胍1M，醋酸钠0.5M，无水乙醇30％；

(9)吸附柱加入200-500μL洗脱液EB洗脱核酸，室温放置5-10min，使核酸充分的从吸附膜上剥离，进行离心，离心速度4000-5000rpm，离心1-3min；所述的洗脱液EB包含Tris-HCl成分，浓度为10mM，pH8.0；所述的洗涤液WB2的配方成分及浓度为：无水乙醇75％；

(10)采用核酸纯化试剂盒进一步纯化离心后的核酸，得到纯化后的核酸。

(11)采用酶标仪对纯化后的粪便总基因组进行浓度和纯度测定，采用Q-PCR方法对人和菌的基因组含量进行测定。

2.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的粪便保存管的容量为30-60mL，要求密闭性较好且防爆，选择Axygen，Corning，ThermoFisher品牌产品。

3.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的粪便样本用量为5-20g，是新鲜样本或冻存样本

4.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的粪便保存液减少粪便细菌的裂解和繁殖，降低上清中菌基因组含量。

5.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的步骤离心是在常温下进行。

6.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的吸附柱从天根公司购买，特异性吸附核酸，最大装量达4mL。

7.根据权利要求1所述的一种粪便人源基因组DNA快速提取及纯化方法，其特征在于所述的核酸纯化试剂盒是柱式腐殖酸清除剂、DNA Clean&concentrator-25(ZYMO)或醋酸钠和异丙醇。