[发明专利]基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法

摘要

本发明共公开了一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。该自杀型质粒的构建包括如下步骤：以pCat‑marinerr质粒为模板进行PCR扩增，将获得的扩增产物作为质粒骨架；然后以pUC57‑tpm质粒为模板扩增tpm抗性基因，再将质粒骨架和tpm抗性基因进行同源重组，得到所述自杀型质粒。本发明中的耐药突变菌株是将自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，然后将获得菌株和目标菌株混合培养，再用含有亚碲酸盐的单药板、以及含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的双药板进行筛选，得到耐药突变菌株。本发明方法操作简单，可高通量的获得转座突变株，适用于构建耐药菌株或筛选药物。

主权项

1.一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以pCat‑marinerr质粒为模板，以序列at‑F和CatR为引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；其中，at‑F和CatR的核苷酸序列如下所示：at‑F:5’‑ccagaactcatgttgcatggtat‑3’；CatR:5’‑ccaagttctgaGCCTTTTTGCG‑3’；(2)以pUC57‑tpm质粒为模板，以序列TPM‑F和TPM‑R为引物，进行PCR扩增，得到tpm抗性基因；其中，TPM‑F和TPM‑R的核苷酸序列如下所示：TPM‑F:5’‑tcagaacttggcagtgagtatcca‑3’；TPM‑R:5’‑atgcaacatgagttctggcat‑3’；(3)将步骤(1)中得到的扩增产物和步骤(2)中得到的tpm抗性基因进行同源重组，得到pTPM‑XY质粒，即所述基于mariner转座子构建的自杀型质粒。