[发明专利]基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法

权利要求书

1.一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以pCat-marinerr质粒为模板，以序列at-F和CatR为引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；其中，at-F和CatR的核苷酸序列如下所示：at-F:5’-ccagaactcatgttgcatggtat-3’；CatR:5’-ccaagttctgaGCCTTTTTGCG-3’；

(2)以pUC57-tpm质粒为模板，以序列TPM-F和TPM-R为引物，进行PCR扩增，得到tpm抗性基因；其中，TPM-F和TPM-R的核苷酸序列如下所示：TPM-F:5’-tcagaacttggcagtgagtatcca-3’；TPM-R:5’-atgcaacatgagttctggcat-3’；

(3)将步骤(1)中得到的扩增产物和步骤(2)中得到的tpm抗性基因进行同源重组，得到pTPM-XY质粒，即所述基于mariner转座子构建的自杀型质粒。

2.一种自杀型质粒，其特征在于：通过权利要求1所述的方法构建得到。

3.权利要求2所述的自杀型质粒在构建荧光菌株中的应用。

4.一种基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(A)将权利要求2所述的自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，得到大肠杆菌WM3064/pTPM-XY；

(B)将大肠杆菌WM3064/pTPM-XY和目标菌株分别培养至对数生长期；

(C)将对数生长期的大肠杆菌WM3064/TPM-XY和目标菌株按体积比1：1～10混合均匀后加入到培养基中进行培养，得到含有细菌的培养液；

(D)将含有细菌的培养液涂布到含有亚碲酸盐的平板上继续培养，然后挑取单菌落同时接种到单药板和双药板上，再挑选双药板上不生长而单药板的菌生长的菌株，得到突变菌株，即所述基于mariner转座突变技术构建的耐药突变菌株；其中，单药板为含有亚碲酸盐的平板，双药板为含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的平板；

步骤(D)中所述的原抗性筛选标记药物为美罗培南。

5.根据权利要4所述的基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，其特征在于：

步骤(B)中所述的目标菌株为嗜麦芽寡氧单胞菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，沙门氏菌和阴沟肠杆菌中的至少一种。

6.根据权利要4所述的基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，其特征在于：

步骤(D)中所述的亚碲酸盐为亚碲酸钠；

步骤(D)中所述的单药板中亚碲酸盐的浓度为25μg/ml；

步骤(D)中所述的双药板中亚碲酸盐的浓度为25μg/ml，原抗性筛选标记药物的浓度为2μg/ml。

7.根据权利要4所述的基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，其特征在于：

步骤(B)中所述的培养大肠杆菌WM3064/pTPM-XY所用的培养基为含50μg/ml二氨荃庚二酸的LB肉汤培养基；

步骤(B)中所述的培养目标菌株所用的培养基为LB肉汤培养基；

步骤(C)中所述的培养基为含50μg/ml二氨荃庚二酸的LB琼脂培养基。

8.根据权利要4所述的基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法，其特征在于：

步骤(C)中所述的培养的时间为2～8h；

步骤(D)中所述的培养的条件为：37℃培养20小时。

9.权利要求1所述的基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法或权利要求4～8任一项所述的基于mariner转座突变技术构建耐药突变菌株的方法在构建耐药菌株、药动药效学评价或筛选药物中的应用。