[发明专利]基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法

说明书

本发明共公开了一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。该自杀型质粒的构建包括如下步骤：以pCat‑marinerr质粒为模板进行PCR扩增，将获得的扩增产物作为质粒骨架；然后以pUC57‑tpm质粒为模板扩增tpm抗性基因，再将质粒骨架和tpm抗性基因进行同源重组，得到所述自杀型质粒。本发明中的耐药突变菌株是将自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，然后将获得菌株和目标菌株混合培养，再用含有亚碲酸盐的单药板、以及含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的双药板进行筛选，得到耐药突变菌株。本发明方法操作简单，可高通量的获得转座突变株，适用于构建耐药菌株或筛选药物。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。

背景技术

细菌耐药性的产生已成为一个令人担忧的问题，耐药细菌越来越多地出现在动物身上，也越来越多地出现在世界各地的人类身上。某些细菌几乎对所有临床药物都耐药，主要是细菌通过水平传播或者垂直传播或自身基因突变获得某些耐药基因。例如基因编码的抗广谱头孢菌素使得细菌可以耐碳青霉烯，基因编码的16s rRNA甲基化酶赋予细菌抵抗氨基糖甙类药物的能力，质粒介导的耐喹诺酮(PMQR)基因赋予细菌耐氟喹诺酮类药物的能力。mcr基因赋予细菌抵抗多粘菌素类药物的能力。基因赋予细菌抵抗某种药物的能力，世界范围类已经发现许多耐药基因。然而，随着细菌进化，许多新型耐药基因尚待挖掘。因此，发现新基因，研究细菌进化特点迫在眉睫。

研究新基因，现有的方法只要有基因敲除，这种方法主要是失活目标基因，从而研究目标基因失活以后细菌表型的变化，从而探究目标基因的功能。该方法是可以用来敲除靶基因，但对于在偌大的细菌染色体组寻找靶基因无异于大海捞针。此外，测序技术的兴起，也为研究新基因提供了新的武器。但是测序技术成本昂贵，测序技术可以用来比较基因序列的同源性，但是对于研究某些差异比较大的亚型，效果不好，且对技术人员要求很高。

原核生物和真核生物基因组中存在着一种可以在基因组中移动的DNA序列，被称为转座子。转座子是基因组内相对独立的、可移动序列，他们不必借助质粒或噬菌体形式就可以从一个位置“跳跃”到另一个位置，从而产生基因突变(Slotkin et al.,2007)。早在1951年美国遗传学家Barbara Mclintock在研究玉米的过程中发现了可移动的DNA转座子，之后又陆陆续续在细菌、真菌以及一切生物中发现了转座子，转座子的发现说明了基因在染色体上的位置并非是固定的(Medhora et al.,1988)。转座子有以下几个特点：1、转座子是基因组的正常组成成分，不独立存在；2、转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个位置直接转移到另一个部位；3、转座随机发生；4、转座子插入引起基因重排使得物种进化。由于转座引起基因的重排使得转座子成为各种生物基因分析的有效工具。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法。

本发明的另一目的在于提供所述基于mariner转座子构建得到的自杀型质粒。

本发明的再一目的在于提供所述自杀型质粒在构建耐药突变菌株中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于mariner转座子构建自杀型质粒的方法，包括如下步骤：

(1)以pCat-marinerr质粒为模板，以序列at-F和CatR为引物，进行PC R扩增，得到扩增产物(作为质粒骨架)；其中，at-F和CatR的核苷酸序列如下所示：at-F:5’-ccagaactcatgttgcatggtat-3’；CatR:5’-ccaagttctgaGCCTTTTTGCG-3’；