[发明专利]包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种包载miRNA‑204‑5p的外泌体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，通过构建稳定过表达抑癌基因miRNA‑204‑5p的稳转株细胞，分离及富集包载miRNA‑204‑5p的外泌体，以外泌体作为miRNA‑204‑5p的药物传递系统，发挥其对肿瘤的治疗作用。本发明提供的包载miRNA‑204‑5p的外泌体，显著提高与肿瘤细胞的相容性，能够高效将miRNA‑204‑5p释放进入肿瘤细胞内，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，显著抑制肿瘤细胞的增殖。通过模拟体内情况，优选操作过程中使用的试剂种类、质量或者浓度等参数，在细胞内将miRNA‑204‑5p自然装载到外泌体中，显著提高miRNA‑204‑5p与外泌体在细胞内的包载效率，降低包载过程中的风险，制备的外泌体更具有稳定性、安全性和高效性。

主权项

1.一种包载miRNA‑204‑5p的外泌体的制备方法，其特征在于，包括：(1)表达载体的构建：合成miRNA‑204‑5p前体的寡聚核苷酸序列；将miRNA‑204‑5p前体双链寡聚核苷酸克隆至pCDH载体中构建表达载体；(2)慢病毒包装：用含有pCDH‑miRNA‑204、病毒包装质粒pA2和包膜质粒pMDG2的第一混合液对HEK‑293T细胞进行转染；培养转染后的HEK‑293T细胞，收集培养液，分离纯化后得到慢病毒；(3)稳转株细胞的建立：用含有聚凝胺、pCDH‑miRNA‑204病毒的第二混合液对HEK‑293T细胞进行转染；再继续培养并用嘌呤霉素筛选得到HEK‑293T稳转株细胞；(4)外泌体的提取：收集步骤(3)中的细胞培养液对外泌体进行分离提取，得到包载miRNA‑204‑5p的外泌体。