[发明专利]包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法，其特征在于，包括：

(1)表达载体的构建：合成miRNA-204-5p前体的寡聚核苷酸序列；将miRNA-204-5p前体双链寡聚核苷酸克隆至pCDH载体中构建表达载体；

(2)慢病毒包装：用含有pCDH-miRNA-204、病毒包装质粒pA2和包膜质粒pMDG2的第一混合液对HEK-293T细胞进行转染；培养转染后的HEK-293T细胞，收集培养液，分离纯化后得到慢病毒；

(3)稳转株细胞的建立：用含有聚凝胺、pCDH-miRNA-204病毒的第二混合液对HEK-293T细胞进行转染；再继续培养并用嘌呤霉素筛选得到HEK-293T稳转株细胞；

(4)外泌体的提取：收集步骤(3)中的细胞培养液对外泌体进行分离提取，得到包载miRNA-204-5p的外泌体。

2.如权利要求1所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，还包括利用大肠杆菌转化所述表达载体，经扩增和纯化后提取所述表达载体。

3.如权利要求1所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法，其特征在于，所述第一混合液中pCDH-miRNA-204、病毒包装质粒pA2和包膜质粒pMDG2的质量比为4:3:1。

4.如权利要求1所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法，其特征在于，所述第二混合液中聚凝胺的浓度为5～8μg/ml。

5.如权利要求1所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(4)后，还包括对所述外泌体进行验证，具体验证外泌体蛋白CD63、flotillin2和内参蛋白β-actin的表达。

6.如权利要求1所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(4)后，还包括：利用叶酸修饰所述包载miRNA-204-5p的外泌体。

7.一种如权利要求1～6任意一项所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的制备方法制备的包载miRNA-204-5p的外泌体。

8.一种如权利要求7所述的包载miRNA-204-5p的外泌体在制备抗肿瘤药物方面的应用。

9.如权利要求8所述的包载miRNA-204-5p的外泌体的应用，其特征在于，所述包载miRNA-204-5p的外泌体在制备靶向抑制肿瘤细胞增殖和/或增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性的药物上的应用。