[发明专利]包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种包载miRNA‑204‑5p的外泌体及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，通过构建稳定过表达抑癌基因miRNA‑204‑5p的稳转株细胞，分离及富集包载miRNA‑204‑5p的外泌体，以外泌体作为miRNA‑204‑5p的药物传递系统，发挥其对肿瘤的治疗作用。本发明提供的包载miRNA‑204‑5p的外泌体，显著提高与肿瘤细胞的相容性，能够高效将miRNA‑204‑5p释放进入肿瘤细胞内，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，显著抑制肿瘤细胞的增殖。通过模拟体内情况，优选操作过程中使用的试剂种类、质量或者浓度等参数，在细胞内将miRNA‑204‑5p自然装载到外泌体中，显著提高miRNA‑204‑5p与外泌体在细胞内的包载效率，降低包载过程中的风险，制备的外泌体更具有稳定性、安全性和高效性。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是导致死亡的第二大主要原因。随着分子生物学的理论及技术方法(特别是重组DNA技术)的迅速发展，人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因，使疾病研究和治疗深入至分子水平，于是诞生了基因诊断、基因治疗技术。基因治疗从基因角度理解是对缺陷的基因进行修复增补，或用正常有功能的基因置换对应缺陷基因的方法。从治疗角度理解是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗最引人瞩目的研究领域，是继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种模式，是肿瘤治疗的有益补充。

近年来，一种被称为微小RNA(miRNA)的非编码RNA分子已被证实可作为肿瘤抑制基因或癌基因，调控癌症的发生发展。这些miRNA长度一般为19到24个核苷酸。miRNA的功能异常参与了几乎所有类型肿瘤的发生发展。通常，miRNA通过反向互补结合到靶基因信使RNA(mRNA)的3’-非翻译区(3’UTR)，对基因进行负调控。miRNA-204曾被报道在多种人类肿瘤中发挥抑制肿瘤功能，其功能低下与多种肿瘤的发生发展密切相关。比如，miRNA-204在乳腺癌、肾透明细胞癌、胰腺癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、胃癌、肝内胆管癌和头颈部肿瘤中抑制生长和/或侵袭。另外，在胃癌和神经母细胞瘤中，miRNA-204能通过靶向BCL2来影响化疗敏感性。本发明前期研究发现，miRNA-204-5p能在体内外抑制结直肠癌的增殖和转移，并且能促进结直肠癌细胞凋亡、增加其对多种药物的化疗敏感性。这些研究表明miRNA-204-5p在肿瘤发生发展中发挥重要作用，具有潜在的应用价值。

目前，脂质体转染是miRNA的重组表达质粒或合成的成熟miRNA序列进入细胞的主要技术手段，miRNA进入细胞后调控其下游靶基因实现其抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡的作用。但是，利用脂质体转染其转染效率不稳定，不同细胞间存在差异，而且脂质体转染试剂毒性较大，作用时间较短，稳定性差。对此，人们又尝试用各种病毒载体将miRNA插入到细胞基因组以解决脂质体转染效率问题。然而，病毒载体对人类基因组的安全仍具有威胁，可能引起免疫反应、整合入基因组的隐患及病毒具有复活毒性的可能等所造成的系列安全问题一直饱受争议，近年来科学家们通过对病毒的改造已经获得符合临床应用要求的病毒过表达系统。