[发明专利]益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用

摘要

本发明涉及一种益生菌传递的哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用，属于生物技术领域，所述方法包括如下步骤：1)tssJ基因片段的克隆与纯化；2)tssJ基因真核表达载体(pCTssJ)的构建；3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建。本发明还提供一种将上述疫苗制备成口服疫苗的方法，该口服疫苗接种方便，能刺激鱼体产生免疫，并对哈维氏弧菌产生很高的保护效应，且对环境无任何危害。

主权项

1.一种益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1)tssJ基因片段的克隆与纯化；2)tssJ基因真核表达载体pCTssJ的构建；3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建；所述的步骤1)tssJ基因片段的克隆与纯化以哈维氏弧菌GDH11385基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得tssJ基因；所述的步骤2)tssJ基因真核表达载体pCTssJ的构建，所述载体为pCN3；所述的步骤3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建，步骤如下：①乳酸乳球菌F3感受态制备将实验室前期分离的乳酸乳球菌F3接种至GM17培养液中，30℃、180rpm振荡过夜培养；按体积比2‑3％的接种量转接溶液Ⅰ中，30℃、180rpm振荡培养至OD600为0.4‑0.9时，离心收集菌体；再用30ml溶液Ⅱ洗涤细胞2次，离心去上清后用1ml溶液Ⅱ悬浮细胞，获得感受态乳酸乳球菌F3；取40μl分装于1.5ml离心管中，‑80℃保存备用；感受态制备液配方：溶液Ⅰ：50ml 2×M17+1ml 50％葡萄糖+34ml 50％蔗糖+10ml 10％甘氨酸+10ml ddH₂O；溶液Ⅱ：34ml 50％蔗糖+10ml甘油+56ml ddH₂O，所述的葡萄糖、蔗糖、甘氨酸的浓度为均为质量比；②pCTssJ质粒转入乳酸乳球菌F3取1μl pCTssJ质粒与40μl感受态乳酸乳球菌F3细胞混合，冰浴10min，转入预冷的电转杯中，电转化条件为：电压2400V、电阻200Ω、电泳25μF；电击后加入SGM17培养液，冰上放置5min，将电转杯中的混合液转入1.5ml离心管中，30℃静置培养2‑3h，离心去掉部分上清液，轻轻混匀菌体，将全部菌液涂布在含有Amp和CaCO₃的固体MRS培养基；30℃静置培养18‑24h；③乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3的筛选与鉴定挑取单菌落至含Amp的MRS培养基中，30℃条件下，180rpm振荡过夜培养；提取重组益生菌质粒，取1μl重组益生菌质粒作为模板，以上游引物CN‑F1：5’‑CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTA‑3’和下游引物CN‑R1：5’‑TGCGGGCCTCTTCGCTATT‑3’，进行PCR检测，筛选获得益生菌传递重组DNA疫苗。