[发明专利]益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用

说明书

本发明涉及一种益生菌传递的哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用，属于生物技术领域，所述方法包括如下步骤：1)tssJ基因片段的克隆与纯化；2)tssJ基因真核表达载体(pCTssJ)的构建；3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建。本发明还提供一种将上述疫苗制备成口服疫苗的方法，该口服疫苗接种方便，能刺激鱼体产生免疫，并对哈维氏弧菌产生很高的保护效应，且对环境无任何危害。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的原核生物基因工程表达，并利用鱼体肠道中分离出的益生菌作为口服传递载体，具体地涉及一种益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用。

背景技术

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖业中最常见的病原菌之一，常引起鱼、虾、蟹、贝等多种水产经济动物疾病的发生，对海水养殖业造成了巨大的经济损失。哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光海洋条件致病细菌，当周围水体环境恶化，水生生动物免疫力低下时，哈维氏弧菌会迅速繁殖，导致其感染弧菌病。近年来，随着海水养殖规模、密度的急剧增加，哈维氏弧菌引起的养殖损失报道日益增多。当前，国内对水产动物细菌性疾病防治多通过大量使用抗生素来实现，从而造成抗生素的滥用和细菌耐药性增加。当务之急是寻找一种环境友好的哈维氏弧菌抗病方法。相对传统的药物防治，疫苗防治有着安全、高效、特异性强，以及保护时间长等诸多的优点，通过基因工程技术构建新型疫苗来防治弧菌病已成为细菌性疾病防治的最主要途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型益生菌传递的哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用方法。所述的该口服疫苗接种方便，能刺激鱼体产生免疫，并对哈维氏弧菌产生很高的保护效应，且对环境无任何危害。

本发明是通过采用如下技术方案实现的：

一种益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：1)tssJ基因片段的克隆与纯化；2)tssJ基因真核表达载体(pCTssJ)的构建；3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建所述的步骤1)tssJ基因片段的克隆与纯化以哈维氏弧菌GDH11385基因组DNA为模板，通过PCR获得tssJ基因；

所述的步骤2)tssJ基因真核表达载体(pCTssJ)的构建，所述载体为pCN3；

所述的步骤3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建：

①乳酸乳球菌F3感受态制备

将实验室前期分离的乳酸乳球菌F3接种至GM17培养液中，30℃、180rpm振荡过夜培养；按体积比2-3％的接种量转接溶液Ⅰ中，30℃、180rpm振荡培养至OD600约为0.4-0.9时，离心收集菌体；再用30ml溶液Ⅱ洗涤细胞2次，离心去上清后用1ml溶液Ⅱ悬浮细胞，获得感受态乳酸乳球菌F3；取40μl分装于1.5ml离心管中，-80℃保存备用；

感受态制备液配方：溶液Ⅰ：50ml 2×M17+1ml 50％葡萄糖+34ml 50％蔗糖+10ml10％甘氨酸+10ml ddH₂O；溶液Ⅱ：34ml 50％蔗糖+10ml甘油+56ml ddH₂O。

②pCTssJ质粒转入乳酸乳球菌F3

取1μl pCTssJ质粒与40μl乳酸乳球菌F3感受态细胞混合，冰浴10min，转入预冷的0.2cm电转杯中，电转化条件为：电压2400V、电阻200Ω、电泳25μF；电击后加入SGM17培养液，冰上放置5min，将电转杯中的混合液转入1.5ml离心管中，30℃静置培养2-3h，离心去掉部分上清液，轻轻混匀菌体，将全部菌液涂布在含有Amp和CaCO₃的固体MRS培养基；30℃静置培养18-24h。

③乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3的筛选与鉴定