[发明专利]益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备及应用

权利要求书

1.一种益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1)tssJ基因片段的克隆与纯化；2)tssJ基因真核表达载体pCTssJ的构建；3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建；

所述的步骤1)tssJ基因片段的克隆与纯化以哈维氏弧菌GDH11385基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得tssJ基因；

所述的步骤2)tssJ基因真核表达载体pCTssJ的构建，所述载体为pCN3；

所述的步骤3)乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3构建，步骤如下：①乳酸乳球菌F3感受态制备

将实验室前期分离的乳酸乳球菌F3接种至GM17培养液中，30℃、180rpm振荡过夜培养；按体积比2-3％的接种量转接溶液Ⅰ中，30℃、180rpm振荡培养至OD600为0.4-0.9时，离心收集菌体；再用30ml溶液Ⅱ洗涤细胞2次，离心去上清后用1ml溶液Ⅱ悬浮细胞，获得感受态乳酸乳球菌F3；取40μl分装于1.5ml离心管中，-80℃保存备用；

感受态制备液配方：溶液Ⅰ：50ml 2×M17+1ml 50％葡萄糖+34ml 50％蔗糖+10ml 10％甘氨酸+10ml ddH₂O；溶液Ⅱ：34ml 50％蔗糖+10ml甘油+56ml ddH₂O，所述的葡萄糖、蔗糖、甘氨酸的浓度为均为质量比；

②pCTssJ质粒转入乳酸乳球菌F3

取1μl pCTssJ质粒与40μl感受态乳酸乳球菌F3细胞混合，冰浴10min，转入预冷的电转杯中，电转化条件为：电压2400V、电阻200Ω、电泳25μF；电击后加入SGM17培养液，冰上放置5min，将电转杯中的混合液转入1.5ml离心管中，30℃静置培养2-3h，离心去掉部分上清液，轻轻混匀菌体，将全部菌液涂布在含有Amp和CaCO₃的固体MRS培养基；30℃静置培养18-24h；

③乳酸乳球菌F3传递重组DNA疫苗pCTssJ/F3的筛选与鉴定

挑取单菌落至含Amp的MRS培养基中，30℃条件下，180rpm振荡过夜培养；提取重组益生菌质粒，取1μl重组益生菌质粒作为模板，以上游引物CN-F1：5’-CTTGCGTTTCTGATAGGCACCTA-3’和下游引物CN-R1：5’-TGCGGGCCTCTTCGCTATT-3’，进行PCR检测，筛选获得益生菌传递重组DNA疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的通过PCR获得tssJ基因，其中tssJ上游引物：5’-CCCGGGATGGACCCATATTCAGATTTAG-3’；tssJ下游引物：5’-CCCGGGCTTTTACGACCAAAGACAGAT-3’。

3.根据权利要求1所述的一种益生菌传递的鱼用哈维氏弧菌口服DNA疫苗的制备方法，其特征在于所述的tssJ基因序列为SEQ NO.1。

4.一种将权利要求1所述疫苗制备成口服疫苗的方法，所述方法具体步骤如下：

①将重组的乳酸乳球菌pCTssJ/F3至含Amp的GM17培养液中，30℃、180rpm振荡过夜培养至OD₆₀₀在0.8；离心后用PBS重悬至浓度为10⁸CFU/ml；

②取适量质量比1.5％的食品级海藻酸钠溶液与重组的乳酸乳球菌pCTssJ/F3充分混合，将混合溶液缓慢滴加含乳化剂Span-80食品级液体石蜡，至液体石蜡终浓度为1.8％(质量比)，1800r/min搅拌，待充分乳化后，将质量比10％的CaCl₂溶液加入乳化好的海藻酸钠细菌混合物中，边加边均匀搅拌，逐步钙化形成微球；

③8000r/min离心5min收集沉淀，用PBS缓冲液洗涤3次后，再用相同的缓冲液重悬；

④将微球悬液与鱼用饲料混合制备成含益生菌数目为10¹⁰/g的口服疫苗，在空调房中晾干，置于4℃保存备用。