[发明专利]抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途

摘要

本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途，文库的构建方法包括以下步骤：从非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞；提取淋巴细胞总mRNA；以总mRNA为模板，合成全基因cDNA；以全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增；构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用连接酶连接后，转化至感受态细胞，加入培养基培养至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。本发明构建的cDNA文库特异性好，可用于筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH，为研究非洲猪瘟病毒的感染机理提供实验依据。

主权项

1.一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离淋巴细胞：从非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；(2)提取淋巴细胞总mRNA：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；(3)合成全基因cDNA：以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；(4)第一轮PCR扩增：以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：CALL001 5’‑GTCCTGGCTGCTCTTCTAVAAGG‑3’CALL002 5’GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC‑3’扩增的产物大小为600bp，保存备用；(5)第二轮PCR扩增：以步骤(4)的扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：H1 5’‑GATGTGCAGGCGCGCGAGTCTGGAGGAGG‑3’H2 5’‑CTAGTGATAGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT‑3’扩增的产物大小为400bp，保存备用；(6)构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用T4 DNA连接酶连接后，电击转化至TG1感受态细胞，迅速加入2YT培养基，直接将菌液吸出加入2YT复苏培养基中进行复苏，然后于37℃倒置过夜培养直至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。