[发明专利]抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途

说明书

本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途，文库的构建方法包括以下步骤：从非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞；提取淋巴细胞总mRNA；以总mRNA为模板，合成全基因cDNA；以全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增；构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用连接酶连接后，转化至感受态细胞，加入培养基培养至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。本发明构建的cDNA文库特异性好，可用于筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白的VHH，为研究非洲猪瘟病毒的感染机理提供实验依据。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)属于双链DNA病毒目中的非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，也是该属的唯一成员。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，长度约170～190k，末端碱基交互连接，形成发夹环，ASFV粒子为呈20面体对称的DNA囊膜病毒，粒子直径为175～215nm，分子量约108Da。ASFV整个基因组含有160～175个开放阅读框(ORF)，能够编码大约200种蛋白质，ASFV分离株中均包含一段位于基因组中心位置的中央保守区(C区)基因，长度约为125kb，该段序列很少有大的基因插入和缺失，其中的一些基因(如P72基因)常常作为ASFV基因的分型依据。在中央保守区还含有一个4kb左右的中央可变区(CVR)，不同基因型或者同一基因型的不同毒株之间的这一区域具有很大的差别。而在基因组两头，大约在右边13-16kb和左边38～47kb的区域内，含有5个多基因家族(MGF)，每个多基因家族都可发生缺失、增加、分化等变异，这种变异在不同毒株间差异很大，主要与病毒抗原变异、免疫逃避等机制有关。非洲猪瘟病毒P30蛋白是其重要的结构蛋白之一，也是在病毒感染早期表达最多的蛋白，研究表明，P30蛋白有很强的免疫原性，是一种重要的非洲猪瘟病毒诊断抗原。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。自2018年8月，非洲猪瘟蔓延至我国各省市，但目前又缺少商品化的非洲猪瘟疫苗，针对该疫情只能选择清群扑杀和封锁，一时间对我国养猪业造成严重的经济损失。

1993年Hamers等报道，骆驼血液中有50％缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体，由于缺失轻链，将这种特殊抗体称之为单链抗体，克隆这种抗体重链的可变区，得到仅有一个结构域的片段，该片段是抗原结合的最小单元，即单域抗体(variable domain of heavychain of heavy 2chain antibody，VHH)，后来又被命名为“纳米抗体”(nanobody)。纳米抗体的大小约15KD，仅为常规的1/10。纳米抗体在极端温度和pH环境中具有良好的稳定性，其水溶性和构象稳定性是常规抗体无法比拟的，且这种单体结构域能高特异性、高亲和力地与抗原结合，从而中和或封闭相对隐蔽的抗原表位。纳米抗体是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最小单元，由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易于表达及免疫原性低等特点，其具有广阔的应用前景，尤其在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值。

噬菌体展示技术是将外源的多肽或者蛋白质的编码序列整合到噬菌体基因组中以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面的一种技术。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体将得到高度富集。