[发明专利]抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离淋巴细胞：从非洲猪瘟病毒P30蛋白免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；

(2)提取淋巴细胞总mRNA：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；

(3)合成全基因cDNA：以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；

(4)第一轮PCR扩增：以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：

CALL001 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTAVAAGG-3’

CALL002 5’GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

扩增的产物大小为600bp，保存备用；

(5)第二轮PCR扩增：以步骤(4)的扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，扩增所用引物的基因序列如下：

H1 5’-GATGTGCAGGCGCGCGAGTCTGGAGGAGG-3’

H2 5’-CTAGTGATAGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3’

扩增的产物大小为400bp，保存备用；

(6)构建获得cDNA文库：使用BSSHII和NheI双酶切第二轮PCR扩增产物和噬菌体载体pHEN2，并将酶切产物使用T4 DNA连接酶连接后，电击转化至TG1感受态细胞，迅速加入2YT培养基，直接将菌液吸出加入2YT复苏培养基中进行复苏，然后于37℃倒置过夜培养直至克隆出现，收集菌液，即得抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。

2.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，合成全基因cDNA的扩增管反应液的组成如下：

3.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，第一轮PCR扩增管反应液的组成如下：

4.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中，第二轮PCR扩增管反应液的组成如下：

5.一种如权利要求1～4任一项所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库。

6.如权利要求5所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库，其特征在于，所述文库的库容为2.2×10⁸cfu/ml，滴度为7.6×10¹³cfu/ml，文库的阳性插入率为91.2％。

7.一种如权利要求5所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用。

8.如权利要求7所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用，其特征在于，筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

9.如权利要求8所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH的噬菌体展示cDNA文库在筛选非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH中的应用，其特征在于，所述筛选出的非洲猪瘟病毒P30蛋白VHH链纯化后的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。