[发明专利]一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法

摘要

本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5‑FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5‑FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。

主权项

1.一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法，其特征在于所述的方法包括：通过融合PCR构建过表达片段，所述的过表达片段组成为内源性强启动子序列+过表达的目的基因完整序列+过表达的目的基因完整终止子序列+U3表达框；所述的内源性强启动子序列通过引物P_F：SEQ ID NO.33和引物P_R：SEQ ID NO.34从贵州木霉NJAU4742基因组DNA中扩增得到；通过原生质体转化将过表达片段转入无痕敲除ura3基因的木霉突变体中并筛选出正确的突变体；其中过表达的目的基因以及其过表达所需的强启动子均为木霉的内源片段；所述的无痕敲除ura3基因的木霉突变体，按照以下方法构建得到：针对ura3基因序列设计四对引物：其中，一对引物扩增ura3基因起始密码子ATG上游的1‑1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增上游片段到ura3基因起始密码子ATG之间的1‑1.5kb序列，为基因片段；一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500‑800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增潮霉素B磷酸转移酶基因完整表达框，命名为HygB抗性基因表达框；上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，其中，上游片段末端与下游片段起始端重合；下游片段末端与HygB抗性基因表达框起始端重合；HygB抗性基因表达框末端与ura3基因片段起始端重合；利用高保真酶从木霉基因组上分别通过PCR扩增得到上游片段、下游片段、ura3基因片段，从pcDNA1质粒上PCR扩增得到HygB抗性基因表达框；通过融合PCR获得上游片段+下游片段+HygB抗性基因表达框+ura3基因片段的ura3基因敲除片段；将该ura3基因敲除片段转化木霉原生质体获得突变体；在含有HygB的PDA培养基上培养突变体，对能够在含有HygB的PDA培养上生长的木霉利用菌丝裂解试剂盒进行突变体第一次同源重组验证，保留发生正确同源重组的突变体菌株，并让其继续生长至产孢；将上述发生第一次同源重组的正确突变体的孢子涂布于含有1.5mg/ml 5‑FOA、5nmol尿苷的GSM固体培养基上进行培养，发生二次同源重组的片段能够在含有5‑FOA和尿苷的GSM平板上萌发并长出菌块，挑取阳性突变体并进行纯化验证后得到无痕敲除ura3基因的木霉突变体。