[发明专利]一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法

说明书

本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5‑FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5‑FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。

分案申请说明

本申请是申请日为2018-02-08，申请号为2018101301042，发明名称为“一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法”的分案申请。

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，涉及一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法。

背景技术

微生物有机肥具有促进植物生长、防控土传病害的功能，能够替代或部分替代化肥，其在农业上的广泛应用符合国家“减肥减药”政策。微生物有机肥中最重要成分为各活性菌株，主要包括细菌分类中的芽孢杆菌属以及真菌分类中的木霉属丝状真菌。长期研究表明，木霉属丝状真菌具有促进植物生长(黄瓜、玉米、香蕉、西瓜等)，诱导植物外源免疫、增强植物系统抗性以及防控土传病害的功能，因其环境友好、功能多样而被广泛应用于微生物有机肥生产。

推广应用的同时，理论研究也是重中之重。木霉的理论研究主要集中在植物促生、病原菌拮抗以及秸秆利用等几个方面，涉及到真菌分子生物学、真菌遗传学、细胞生物学、植物营养学等诸多学科之间的交叉。在这一过程中，一套成熟的遗传操作手段对于木霉各功能内在机制的深入探究是必需的。本发明人所在团队前期工作表明，木霉只对少数抗生素敏感，其中潮霉素B(Hygromycin B)得以应用，并利用潮霉素B磷酸转移酶编码基因的外源导入，经转化、筛选、纯化后验证等步骤成功实现了木霉中基因的敲除和过表达。然而，木霉不同功能的内在机制十分复杂，是一种多基因参与、共同调控的结果。上述基于潮霉素B的遗传操作只能针对木霉基因组中的单个基因进行，在很多情况下对单一基因性状和功能的研究远远不能够解释多基因产物互作的综合结果(促生、拮抗、秸秆利用等)。同时，理论研究的最终目的是推向应用，对木霉各功能内在机制的深入研究帮助我们理解它是如何有效促进植物生长和防控土传病害的同时，也给我们增强其功能提供有效路径，从而不断提高微生物有机肥的田间功效。出于生物安全考虑，微生物有机肥中主要功能菌株的人工遗传改造是不能够带入任何外源DNA片段的。综上考虑，木霉的理论研究和实际应用中都需要一种无痕迹的能够实现无基因数量限制的快速、高效、可循环的基因编辑系统。

发明内容

本发明的目的是针对木霉多基因遗传操作十分困难的现实，提供一种无痕迹的可循环操作的木霉基因编辑方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一株木霉ura3基因无痕敲除突变体构建,包括以下步骤: