[发明专利]一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法

权利要求书

1.一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法，其特征在于所述的方法包括：过表达采用的目的基因以及其过表达所需的强启动子均为木霉的内源片段，通过融合PCR将U3表达框和目的基因过表达框融合成一个完整的片段通过原生质体转化将过表达片段转入无痕敲除ura3基因的木霉突变体中并筛选出正确的突变体；

所述的过表达片段通过以下方法构建:强启动子序列通过引物P_F： SEQ ID NO.33和引物P_R： SEQ ID NO.34从NJAU4742基因组DNA中扩增得到；过表达的目的基因完整序列和过表达的目的基因完整终止子序列通过PCR从NJAU4742基因组DNA中扩增得到；U3表达框通过引物U3box_F： SEQ ID NO.37和U3box_R： SEQ ID NO.38从NJAU4742基因组DNA中扩增得到，通过融合PCR步骤获得最终过表达片段产物；融合PCR第一步反应体系中HiFi Premix10 µl，四种片段各2 µl，ddH₂O 2 µl，反应程序为98℃ 1s，（98℃ 10s，60℃ 7s，72℃40s）_15个循环，4℃保存;融合PCR第二步反应体系中HiFi Premix 25 µl，第一步反应产物4 µl，U3_upF和U3_geneR引物各2 µl，ddH₂O 17 µl，反应程序为98℃ 1s，（98℃ 10s，60℃ 7s，72℃ 40s）_30个循环，4℃保存；

所述的无痕敲除ura3基因的木霉突变体，按照以下方法构建得到：针对ura3基因序列设计四对引物：其中，一对引物扩增ura3基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增上游片段到ura3基因起始密码子ATG之间的1-1.5kb序列，为基因片段；一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500-800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增潮霉素B磷酸转移酶基因完整表达框，命名为HygB抗性基因表达框；上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，其中，上游片段末端与下游片段起始端重合；下游片段末端与HygB抗性基因表达框起始端重合；HygB抗性基因表达框末端与ura3基因片段起始端重合；利用高保真酶从木霉基因组上分别通过PCR扩增得到上游片段、下游片段、ura3基因片段，从pcDNA1质粒上PCR扩增得到HygB抗性基因表达框；通过融合PCR获得上游片段+下游片段+HygB抗性基因表达框+ ura3基因片段的ura3基因敲除片段；将该ura3基因敲除片段转化木霉原生质体获得突变体；在含有HygB的PDA培养基上培养突变体，对能够在含有HygB的PDA培养上生长的木霉利用菌丝裂解试剂盒进行突变体第一次同源重组验证，保留发生正确同源重组的突变体菌株，并让其继续生长至产孢；将上述发生第一次同源重组的正确突变体的孢子涂布于含有1.5 mg/ml 5-FOA、5 nmol 尿苷的GSM固体培养基上进行培养，发生二次同源重组的片段能够在含有5-FOA和尿苷的GSM平板上萌发并长出菌块，挑取阳性突变体并进行纯化验证后得到无痕敲除ura3基因的木霉突变体。

2.根据权利要求1所述的无痕迹木霉真菌基因过表达方法，其特征在于其特征在于包括以下步骤：

（1）过表达片段构建

（2）过表达片段转化

通过原生质体转化将过表达片段转入无痕敲除ura3基因的木霉突变体中；

（3）过表达突变子筛选、纯化及qPCR验证

上述双层筛选平板于28℃培养培养48-72 h后，会在上层GSM培养基表面长出明显的圆形菌落，将其转接到新的GSM固体平板上，利用菌丝裂解试剂盒提取突变体DNA，通过PCR验证过表达片段是否被正确插入基因组中获得过表达突变体，突变体能够在不添加尿苷或尿嘧啶的GSM培养基上正常生长，ura3基因的得到正确回补；

将过表达突变体和原始菌株NJAU4742在GSM液体培养基中发酵，回收二者菌丝体，提取突变体和原始菌株总RNA，将总RNA中的mRNA反转录成cDNA，然后，利用定量PCR试剂盒进行过表达目的基因转录水平的验证。

3.根据权利要求1所述的无痕迹木霉真菌基因过表达方法，其特征在于所述的木霉为含有ura3基因的木霉。