[发明专利]基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒。采用标准LAMP引物和DNA荧光结合染料，扩增完成后直接进行熔解，对采集的熔解曲线进行归一化或主成分分析，即可实现多重LAMP靶标来源的同时检测。相比传统的熔解曲线分析，该方法采用整个熔解曲线信息而非Tm值进行鉴别检测；显著降低了多重LAMP分析引物的设计难度，使得具有微小Tm差异的多个LAMP扩增产物也能够被同时检测，避免了多色荧光标记或者在空间分隔平行进行多个单重扩增反应；一次可同时检测的目标DNA数量显著增加，鉴别能力不受模板初始浓度的影响，灵敏度可达10拷贝，在复杂样品中显现出优良的检测性能，具有较强实际应用价值。

主权项

1.一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)靶序列单重LAMP扩增根据各目标检测物样品中待检测目的基因的不同选取靶序列并针对各个靶序列设计对应的引物，提取目标检测物样品内的DNA，将该DNA作为模板；将模板及对应引物进行单重LAMP扩增反应，根据反应结果确定LAMP扩增反应的反应体系；2)多重LAMP反应条件优化将步骤1)涉及的目标检测物样品两两进行组合，然后针对组合后对应的两个模板同时进行LAMP扩增反应，扩增反应后获取高分辨率熔解曲线，然后根据对应两个扩增产物的解链峰的差异程度优化所述扩增反应的反应条件；将不同目标检测物样品组合对应的反应条件的优化结果进行合并，得到多重LAMP扩增反应的反应条件；3)多重扩增检测经过步骤2)后，提取待测样品中的DNA，并以该DNA为模板进行多重LAMP扩增反应，扩增反应后获取高分辨率熔解曲线，然后对高分辨率熔解曲线进行归一化或对高分辨率熔解曲线进行主成分分析，然后与同样采用归一化或主成分分析构建得到的标准高分辨率熔解曲线模型进行比对，根据比对结果，鉴别待测样品所含单个靶序列或多个靶序列。