[发明专利]基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于高分辨率熔解的非疾病诊断多重环介导等温核酸扩增检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)靶序列单重LAMP扩增

根据各目标检测物样品中待检测目的基因的不同选取靶序列并针对各个靶序列设计对应的特异性引物，提取目标检测物样品内的DNA，将该DNA作为模板；将模板及对应引物进行单重LAMP扩增反应，根据反应结果确定LAMP扩增反应的反应体系；

2)多重LAMP反应条件优化

将步骤1)涉及的目标检测物样品两两进行组合，然后针对组合后对应的两个模板同时进行LAMP扩增反应，扩增反应后获取高分辨率熔解曲线，然后根据对应两个扩增产物的解链峰的差异程度优化所述扩增反应的反应条件；将不同目标检测物样品组合对应的反应条件的优化结果通过取交集进行合并，得到多重LAMP扩增反应的反应条件；

所述步骤2)中，优化所述扩增反应的反应条件具体包括以下步骤：确定两个模板同时扩增所得扩增产物的熔解温度差异，若所述熔解温度差异3℃，选取使该两个模板对应解链峰面积相等时的反应温度为优化的反应温度，若所述熔解温度差异≤3℃，选取使该两个模板的扩增产物的归一化高分辨率熔解曲线位于对应单个模板扩增产物的归一化高分辨率熔解曲线之间时的反应温度为优化的反应温度，当混合模板样品归一化高分辨率熔解曲线位于对应两个单模板样品对照正中间时，则两靶标都实现了扩增，且扩增效率接近；

3)多重扩增检测

经过步骤2)后，提取待测样品中的DNA，并以该DNA为模板进行多重LAMP扩增反应，扩增反应后获取高分辨率熔解曲线，然后对高分辨率熔解曲线进行归一化，然后与同样采用归一化构建得到的在不同目标检测物样品间互不重叠的标准高分辨率熔解曲线模型进行比对，根据比对结果，鉴别待测样品所含单个靶序列或多个靶序列；多重LAMP扩增反应选自三重以上LAMP扩增反应。

2.根据权利要求1所述的多重环介导等温核酸扩增检测方法，其特征在于：所述DNA的提取采用试剂盒法。

3.根据权利要求1所述的多重环介导等温核酸扩增检测方法，其特征在于：所述标准高分辨率熔解曲线模型的构建方法具体包括以下步骤：对步骤1)涉及的目标检测物样品所对应的每个模板，分别使用针对全部靶序列的引物进行多重LAMP扩增反应，然后获取高分辨率熔解曲线，并分别采用归一化对对应高分辨率熔解曲线轮廓进行特征提取。

4.根据权利要求1所述的多重环介导等温核酸扩增检测方法，其特征在于：所述靶序列选自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的fem基因、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的virR基因、沙门氏菌属的invA基因中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的多重环介导等温核酸扩增检测方法，其特征在于：所述步骤3还包括以下步骤：对高分辨率熔解曲线进行主成分分析。