[发明专利]基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒。采用标准LAMP引物和DNA荧光结合染料，扩增完成后直接进行熔解，对采集的熔解曲线进行归一化或主成分分析，即可实现多重LAMP靶标来源的同时检测。相比传统的熔解曲线分析，该方法采用整个熔解曲线信息而非Tm值进行鉴别检测；显著降低了多重LAMP分析引物的设计难度，使得具有微小Tm差异的多个LAMP扩增产物也能够被同时检测，避免了多色荧光标记或者在空间分隔平行进行多个单重扩增反应；一次可同时检测的目标DNA数量显著增加，鉴别能力不受模板初始浓度的影响，灵敏度可达10拷贝，在复杂样品中显现出优良的检测性能，具有较强实际应用价值。

技术领域

本发明涉及结合高分辨率熔解曲线分析(HRM)、多元统计及环介导等温核酸扩增(LAMP)技术同时检测多个DNA片段的方法，具体涉及利用高分辨熔解曲线对多重LAMP中的多个扩增子进行区分鉴定的方法。

背景技术

环介导等温核酸扩增(LAMP)由于其高灵敏度和特异性，及高速扩增和对实际样品中存在的各种抑制剂的耐受性，是最广泛使用和研究的等温扩增技术。然而，由于LAMP扩增产物不像聚合酶链式反应(PCR)的产物那样具有已知特定大小的片段，其凝胶电泳为阶梯状结构，不能通过传统凝胶电泳观察扩增产物条带大小和数量来进行多重的检测。

核酸的多重等温扩增和检测在临床检验、食品安全和环境分析在内的多个领域可以节省成本和时间，具有十分重要的意义。为了实现LAMP技术的多重检测，前人通过空间并行的多个单反应检测予以实现，例如，DNA结合染料、浊度法和焦磷酸盐离子指示剂。但是，这些与序列无关的检测手段可能产生假阳性结果，并且需要将样品分成几个单重反应。相比之下，可以在单一体系中同时检测多个靶标才真正意义上实现了多重LAMP。为了一次区分不同的扩增子，有文献报导利用在LAMP扩增后增加限制性消化，然后进行凝胶电泳或焦磷酸测序(Iseki,H.,et al.Journal of Microbiological Methods,2007.71.281.Liang,C.,et al.Analytical Chemistry,2012.84.3758.)的处理步骤，可以实现多个目标的检测，但由于需要开管，因此有生成气溶胶污染的风险且操作复杂、费时费力。多色荧光检测能够在闭管中实现多个目标的序列特异性检测，但是所采用的DNA链置换检测容易抑制LAMP反应，并且多色荧光标记和多通道光学元件导致检测成本较高。

熔解曲线分析提供了一种实现多重LAMP检测的方法，它具有操作简便、检测迅速、密封无污染、成本低的优点。由于DNA解链温度(即，熔解温度，Tm)主要取决于不同的扩增子序列长度和GC含量，使得多重LAMP扩增的熔解曲线分析可以在一管内同时检测多个DNA序列。然而，传统多重熔解曲线分析需要体系内的扩增子在熔解温度上具有3～5℃的差异(姜侃,et al.现代食品科技,2016.32.246；姜侃,et al.食品与机械,2015.31.87.)，因此，要求多重LAMP引物设计需要确保其特异性，避免引物之间的相互作用，并产生具有足够Tm差异的扩增子。但引物设计的复杂性以及后续的优化步骤限制了这一类多重LAMP检测的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法，包括以下步骤：

1)靶序列单重LAMP扩增

根据各目标检测物样品中待检测目的基因的不同选取靶序列并针对各个靶序列设计对应的引物(标准LAMP特异性引物)，提取目标检测物样品内的DNA，将该DNA作为模板；将模板及对应引物进行单重LAMP扩增反应，根据反应结果确定LAMP扩增反应的反应体系(主要是确定针对靶序列的引物的有效性)；

2)多重LAMP反应条件优化