[发明专利]猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法及其应用在审
| 申请号： | 201811575572.7 | 申请日： | 2018-12-22 |
| 公开（公告）号： | CN109609691A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 郑兰兰;魏战勇;王松山;朱静静;王盼;梁青青;李炳晓 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 郑州优盾知识产权代理有限公司 41125 | 代理人： | 张真真;孙诗雨 |
| 地址： | 450002 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明涉及生物分子学领域，特别是指猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法及其应用。设计一对引物用于扩增PDCoV M基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18‑T载体，并构建重组质粒作为标准品模板，在M基因序列内，设计合成一对特异性引物与TaqMan探针，通过反应条件和反应体系的优化，建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测方法，并对其敏感性、特异性与重复性进行验证。本发明能有效扩增1.0×101‑1.0×109拷贝/μL的PDCoV标准质粒以及其它阳性样品，并且呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×101拷贝/μL；该方法具有良好的特异性、重复性。 | ||
| 搜索关键词： | 冠状病毒 拷贝 扩增 荧光定量RT-PCR 构建重组质粒 基因片段克隆 设计一对引物 实时荧光定量 标准品模板 检测灵敏度 生物分子学 特异性引物 标准质粒 反应条件 快速检测 设计合成 线性关系 阳性样品 荧光定量 测序 应用 验证 检测 优化 | ||
【主权项】：
1.猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）猪δ冠状病毒的荧光定量引物和探针的设计；（2）荧光定量RT‑PCR检测分别以浓度梯度为1.0×101‑1.0×109拷贝/μL的标准质粒为模板，以猪δ冠状病毒的定量引物为引物，并加入TaqMan探针、2×Premix Ex Taq和去离子水组成的反应体系进行荧光定量RT‑PCR；（3）以荧光定量RT‑PCR检测到的Ct值为Y轴，以标准质粒的浓度为X轴，建立标准曲线，其标准方程为y = ‑3.272x + 42.37，相关系数R2为0.992；（4）将步骤（2）反应体系中的标准质粒换成待测样品的cDNA，按照步骤（2）中的体系和反应条件进行荧光定量RT‑PCR，并记下Ct值，代入标准方程即得待测样品的cDNA的浓度，即为待测样品中猪δ冠状病毒的浓度。
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