[发明专利]猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法及其应用

说明书

本发明涉及生物分子学领域，特别是指猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法及其应用。设计一对引物用于扩增PDCoV M基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18‑T载体，并构建重组质粒作为标准品模板，在M基因序列内，设计合成一对特异性引物与TaqMan探针，通过反应条件和反应体系的优化，建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测方法，并对其敏感性、特异性与重复性进行验证。本发明能有效扩增1.0×10¹‑1.0×10⁹拷贝/μL的PDCoV标准质粒以及其它阳性样品，并且呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10¹拷贝/μL；该方法具有良好的特异性、重复性。

技术领域

本发明涉及生物分子学领域，特别是指猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法及其应用。

背景技术

猪δ冠状病毒PDCoV是一种新发的猪肠道冠状病毒，属于冠状病毒科，deltacoronavirus病毒属，为有囊膜的单股正链RNA 病毒。PDCoV最早于2012年从猪粪便样品中检测到，并进行了病毒全基因组序列测定。2014年，美国俄亥俄州、伊利诺伊州等猪场相继爆发仔猪腹泻，之后20多个州的猪场都检测到PDCoV，并首次分离到PDCoV。随后在韩国、泰国等多个亚洲国家也检测到PDCoV感染仔猪，我国也普遍存在PDCoV感染的现象。PDCoV可以感染各个年龄段的猪，但以新生仔猪为主，临床症状主要表现为腹泻、呕吐。与猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）及传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroent eritis virus,TGEV）引发的疾病症状非常相似，是当前严重危害世界各国养猪业的重要病毒性腹泻病毒之一，给猪场带来了一定的经济损失。

目前，PDCoV的检测方法主要有ELISA、RT-PCR、巢氏RT-PCR等，这些方法在PDCoV的检测中发挥了重要作用，但存在敏感性不高、稳定性较差的问题。本申请旨在建立一种快速、高效、特异性检测PDCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并用此方法对河南地区收集的100份猪场临床样品进行检测，为PDCoV流行病学调查提供一定的理论依据。

发明内容

本发明提供了猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法及其应用，以PDCoV防控为目的，选取PDCoV M基因的保守序列，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，可用于该病毒的分子流行病学调查和疫病的监测监控，了解该病毒在我国的流行情况，解决了快速、灵敏检测猪δ冠状病毒的技术问题。

本发明的技术方案如下：

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，步骤如下：

（1）猪δ冠状病毒的荧光定量引物和探针的设计；

（2）荧光定量RT-PCR检测分别以浓度梯度为1.0×10¹-1.0×10⁹拷贝/μL的标准质粒为模板，以猪δ冠状病毒的定量引物为引物，并加入TaqMan探针、2×Premix Ex Taq和去离子水组成的反应体系进行荧光定量RT-PCR；

（3）以荧光定量RT-PCR检测到的Ct值为Y轴，以标准质粒的浓度为X轴，建立标准曲线，其标准方程为y = -3.272x + 42.37，相关系数R²为0.992；

（4）将步骤（2）反应体系中的标准质粒换成待测质粒，按照步骤（2）中的体系和反应条件进行荧光定量RT-PCR，并记下Ct值，代入标准方程即得待测质粒的浓度，即为待测样品中猪δ冠状病毒的浓度。