[发明专利]猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法及其应用在审
| 申请号： | 201811575572.7 | 申请日： | 2018-12-22 |
| 公开（公告）号： | CN109609691A | 公开（公告）日： | 2019-04-12 |
| 发明（设计）人： | 郑兰兰;魏战勇;王松山;朱静静;王盼;梁青青;李炳晓 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 郑州优盾知识产权代理有限公司 41125 | 代理人： | 张真真;孙诗雨 |
| 地址： | 450002 河*** | 国省代码： | 河南;41 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 冠状病毒 拷贝 扩增 荧光定量RT-PCR 构建重组质粒 基因片段克隆 设计一对引物 实时荧光定量 标准品模板 检测灵敏度 生物分子学 特异性引物 标准质粒 反应条件 快速检测 设计合成 线性关系 阳性样品 荧光定量 测序 应用 验证 检测 优化 | ||
1.猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）猪δ冠状病毒的荧光定量引物和探针的设计；
（2）荧光定量RT-PCR检测分别以浓度梯度为1.0×101-1.0×109拷贝/μL的标准质粒为模板，以猪δ冠状病毒的定量引物为引物，并加入TaqMan探针、2×
（3）以荧光定量RT-PCR检测到的Ct值为Y轴，以标准质粒的浓度为X轴，建立标准曲线，其标准方程为y = -3.272x + 42.37，相关系数R2为0.992；
（4）将步骤（2）反应体系中的标准质粒换成待测样品的cDNA，按照步骤（2）中的体系和反应条件进行荧光定量RT-PCR，并记下Ct值，代入标准方程即得待测样品的cDNA的浓度，即为待测样品中猪δ冠状病毒的浓度。
2.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中荧光定量引物为PDCoV-F2序列如GACTCCTTGCAGGGATTATGG所示和PDCoV-R2序列如GCTTAACGACTGGTGTGAGAA所示；TaqMan探针序列如FAM-ATGGGTACATGGAGGTGCATTCCC-TAMRA所示。
3.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中荧光定量RT-PCR的反应体系为：2×
4.根据权利要求1所述的猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中标准质粒的制备方法为：根据GenBank中登录的PDCoV M基因序列，设计M基因的引物，以PDCoV阳性样品cDNA为模板，扩增得到M基因片段，然后将该片段克隆到pMD18-T载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证，所得重组质粒即为标准质粒。
5.根据权利要求4所述的猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述M基因的引物为PDCoV-F1：CTATGTCTGACGCAGAAGAGTG、PDCoV-R1：GATGTGCCGCTTATTGCA。
6.权利要求1-5任一项所述的猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法在快速、灵敏检测猪δ冠状病毒中的应用，所述荧光定量RT-PCR检测方法的最低检测限为10拷贝/μL。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于河南农业大学，未经河南农业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201811575572.7/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
