[发明专利]一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法

摘要

本发明涉及一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，属于分子生物学领域。本发明通过设计多条重叠引物，经过PCR扩增合成一段完整的DNA片段，后者体外转录成sgRNA，与Cas9酶结合使其发挥核酸切割功能。本发明首次使用多条重叠引物一步合成sgRNA的DNA模板，并且通过实验证明其具有高的剪切效率。本发明建立的这种方法在快速合成sgRNA，减少实验耗损方面具有价值。

主权项

1.一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)基因靶位点的设计：三个基因的靶位点分别是EGFR‑Exon19 sgRNA：5'‑CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGA‑3'，pu57‑1 sgRNA：5'‑TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGG‑3'，pu57‑2 sgRNA：5'‑CCACTGGTAACAGGATTAGCAG‑3'；(2)多条重叠引物的设计：AF1；AF2：5'‑GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC‑3'；AF3：5'‑GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT‑3'；Tracr‑R：AAAA5'‑AAGCACCGACTCGGTGCCAC‑3'；AF1选自EGFR‑AF1：5'‑TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA‑3'；pu57‑1‑AF1：5'‑TTCTAATACGACTCACTATAGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATA‑3'；或者pu57‑2‑AF1：5'‑TTCTAATACGACTCACTATAGCTGCTAATCCTGTTACCAGGTTTTAGAGCTAGAAATA‑3'；(3)获得sgRNA的DNA模板：将步骤2)中的多条重叠引物进行PCR扩增，通过引物之间的重叠部分合成一段完整的DNA序列，然后将PCR扩增产物纯化；(4)获得sgRNA mRNA：将纯化后的步骤3)中的sgRNA的DNA模板经过体外转录成sgRNA mRNA，纯化后分装保存；(5)获得Cas9/sgRNA识别的目的DNA片段：在pUC57载体的两端设计两条引物PU57‑F：5'‑CGAATGCATCTAGATATCGG‑3'和PU57‑R：5'‑TTACGCCAAGCTTGCATGCA‑3'，扩增包含EGFR‑Exon19在内的664bp大小的DNA片段作为切割靶序列，PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行纯化；(6)检测sgRNA的活性和特异：将步骤4)获得的sgRNA mRNA与Cas9蛋白以及步骤(5)获得的目的DNA片段和Cas9缓冲液混合，通过琼脂糖凝胶电泳分析切割的片段。