[发明专利]一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法

说明书

本发明涉及一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，属于分子生物学领域。本发明通过设计多条重叠引物，经过PCR扩增合成一段完整的DNA片段，后者体外转录成sgRNA，与Cas9酶结合使其发挥核酸切割功能。本发明首次使用多条重叠引物一步合成sgRNA的DNA模板，并且通过实验证明其具有高的剪切效率。本发明建立的这种方法在快速合成sgRNA，减少实验耗损方面具有价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法。

技术背景

CRISPR是指成簇的规律的短回文重复序列(Clustered Regularly InterspersedShort Palindromic Repeats)，CRISPR/Cas9系统主要由三部分构成：crRNA(CRISPR-derived RNA)，tracrRNA(trans-activating RNA)和Cas9，crRNA通过碱基配对和tracrRNA结合形成向导RNA(Single guide RNA，sgRNA)，后者招募Cas9蛋白，而Cas9是CRISPR附近的相关基因，其编码的蛋白具有核酸酶功能，可以切割特定的DNA序列，产生双链断裂(DSB，DNA double-strand break)，之后通过两种修复机制(同源重组修复，非同源重组修复)形成突变，导致基因敲除。

利用CRSPR体系改造的基因编辑功能，在生物医学和工农业多方面具有广泛应用。其中一个关键点是sgRNA的制备。sgRNA既可以化学合成，也可以通过分子生物学的方法如PCR技术而得到。PCR是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，其应用非常广泛。常规PCR技术灵敏度高，特异性好，操作简便，不但用于基因序列分析、鉴定等基础方面的研究，还用于多种疾病的基因诊断。常见的PCR衍生技术有反转录PCR，实时荧光定量PCR，原位PCR，重叠延伸PCR，免疫PCR等。重叠延伸PCR是通过设计具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而连接不同的DNA片段，该技术主要应用于长片段的合成，基因的定点修饰，如替换，插入或删除。

发明内容

本发明旨在提供一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，包括如下步骤：

(1)基因靶位点的设计：三个基因的靶位点分别是EGFR-Exon19sgRNA：5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGA-3'，pu57-1sgRNA：5'-TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGG-3'，pu57-2sgRNA：5'-CCACTGGTAACAGGATTAGCAG-3'；

(2)多条重叠引物的设计：AF1；AF2：5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC-3'；AF3：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT-3'；Tracr-R：AAAA5'-AAGCACCGACTCGGTGCCAC-3'；

AF1可以选自EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；pu57-1-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；或者pu57-2-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTGCTAATCCTGTTACCAGGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；优选地，AF1为EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；