[发明专利]一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法

权利要求书

1.一种利用多条重叠引物PCR法快速制备sgRNA的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）基因靶位点的设计：三个基因的靶位点分别是EGFR-Exon19 sgRNA：5'-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAGA-3'，pu57-1 sgRNA：5'-TAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGG-3'，pu57-2sgRNA：5'-CCACTGGTAACAGGATTAGCAG-3'；

（2）多条重叠引物的设计：AF1；AF2：5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC-3'；AF3：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT-3'；Tracr-R：AAAA5'-AAGCACCGACTCGGTGCCAC-3' ；

AF1选自EGFR-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；或者pu57-1-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；或者pu57-2-AF1：5'-TTCTAATACGACTCACTATAGCTGCTAATCCTGTTACCAGGTTTTAGAGCTAGAAATA-3'；

（3）获得sgRNA的DNA模板：将步骤2）中的多条重叠引物进行PCR扩增，通过引物之间的重叠部分合成一段完整的DNA序列，然后将PCR扩增产物纯化；

（4）获得sgRNA mRNA：将纯化后的步骤3）中的sgRNA的DNA模板经过体外转录成sgRNAmRNA，纯化后分装保存；

（5）获得Cas9/sgRNA识别的目的DNA片段：在pUC57载体的两端设计两条引物PU57-F：5'-CGAATGCATCTAGATATCGG-3'和PU57-R：5'-TTACGCCAAGCTTGCATGCA-3'，扩增包含EGFR-Exon19在内的664bp大小的DNA片段作为切割靶序列，PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行纯化；

（6）检测sgRNA的活性和特异：将步骤4）获得的sgRNA mRNA与Cas9蛋白以及步骤（5）获得的目的DNA片段和Cas9 缓冲液混合，通过琼脂糖凝胶电泳分析切割的片段；

步骤（2）中所述AF1、AF2、AF3、Tracr-R四条引物之间具有重叠的碱基序列，它们之间的作用方式如下：首先是AF3和tracr-R通过重叠序列延伸一段DNA片段，然后该DNA片段再与AF2以相同的方式延伸，依次反应，直至形成DNA片段与AF1重叠互补配对，合成一条完整的DNA片段，在后续的反应中，再以完整的DNA片段为模板，通过AF1和tracr-R引物扩增使产物倍增从而获得用可用于转录的模板；

步骤（2）中所述AF1、AF2、AF3、tracr-R的初始浓度分别为10μM、10μM、1.0μM、10μΜ；

所述AF1、AF2、AF3、tracr-R的最终浓度分别为1.25μM、0.25μM、0.05μM、1.25μM；

步骤（3）中所述PCR扩增的反应程序为：93~97℃，0.8~1.5min；55~57℃，0.8~1.5min；70~75℃，0.8~1.5min；70~75℃，1~3min；循环数为28~40次；

步骤（3）中所述PCR扩增的体系包括：聚合酶2×预混液、AF1、AF2、AF3、Tracr-R和无核糖核酸酶水；

步骤（4）中所述体外转录体系包括：缓冲液、ATP、GTP、CTP、UTP、DNA；

步骤（5）中所述PCR扩增体系包括：聚合酶2×预混液、PU57-F、PU57-R、质粒DNA和无核糖核酸酶水；

其中，所述PU57-F和PU57-R的初始浓度均为18~22μM，所述质粒DNA的浓度为1~2ng/μl；

步骤（5）中所述PCR扩增的反应程序为：95~100℃，1~3min；95~100℃，8~12s；53~56℃，12~16s；70~75℃，25~33s；70~75℃，1~3min；循环数为30~40次；

步骤（6）中的反应体系包括：缓冲液、步骤（4）所述sgRNA mRNA、步骤（5）所述目的DNA片段、Cas9酶和无核糖核酸酶水；

所述sgRNA mRNA的浓度为480~520 ng/μl，Cas9酶的浓度为90~120 ng/μl，目的DNA片段的浓度为50~70ng/μl。