[发明专利]一种山丹脱毒快繁方法

摘要

本发明涉及一种山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：蒴果取材、表面灭菌、胚珠培养、组培苗病毒检测、试管苗扩繁、试管鳞茎膨大及生根。本发明无毒苗获得不经愈伤组织途径，由不含病毒的胚珠直接诱导形成大量初代无毒山丹试管苗，操作简单、培养周期短、脱毒彻底，污染率低，从胚珠接种到萌发只需要40d左右的时间，脱毒率达到100%，基本不会发生污染，并且不会对山丹野生资源造成破坏。同时，由于再生过程不经愈伤组织途径，不容易引起基因变异，本发明繁殖系数高达7.26，并能在短时间内获得大规格的试管鳞茎，91.3%试管鳞茎重量超过0.5g，并且试管鳞茎膨大和诱导生根同步进行。

主权项

1.一种山丹脱毒快繁方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基MS+NAA上，促进萌发培养基MS+NAA为MS+40‑60g/L蔗糖+0.01‑0.1mg/L NAA+ 6.5‑7.0g/L琼脂粉，pH 5.4‑5.6；高温条件下高压灭菌15‑20分钟；步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，根据黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用RT‑PCR对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明脱毒；步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基MS+KT+NAA，扩繁培养基MS+KT+NAA为MS+20‑40g/L蔗糖+1.0‑3.0mg/L KT+0.2‑1mg/L NAA+ 6.5‑7.0g/L 琼脂粉，pH5.7‑6.0；步骤（6）、试管鳞茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基。