[发明专利]一种山丹脱毒快繁方法

说明书

本发明涉及一种山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：蒴果取材、表面灭菌、胚珠培养、组培苗病毒检测、试管苗扩繁、试管鳞茎膨大及生根。本发明无毒苗获得不经愈伤组织途径，由不含病毒的胚珠直接诱导形成大量初代无毒山丹试管苗，操作简单、培养周期短、脱毒彻底，污染率低，从胚珠接种到萌发只需要40d左右的时间，脱毒率达到100%，基本不会发生污染，并且不会对山丹野生资源造成破坏。同时，由于再生过程不经愈伤组织途径，不容易引起基因变异，本发明繁殖系数高达7.26，并能在短时间内获得大规格的试管鳞茎，91.3%试管鳞茎重量超过0.5g，并且试管鳞茎膨大和诱导生根同步进行。

技术领域

本发明涉及一种快繁方法，尤其是一种山丹脱毒快繁方法，属于组织培养领域。

背景技术

山丹（Liliumpumilum DC.）为百合科百合属多年生草本植物，其株形秀丽、花瓣反卷、花色美丽娇艳，极具观赏价值，适宜成片种植于疏林下、草坪边，也可用于花坛、花境及盆栽观赏。同时，山丹还是重要的中药材，其地下鳞茎具有润肺止咳，清热安神、解渴润燥、防癌抗癌等功效，对虚劳咳嗽，吐血，虚烦，惊悸，浮肿等病症有良好疗效，在众多方剂中得到广泛应用。山丹由于其极强的抗寒、抗旱和耐盐碱特性，是观赏和食用百合种质创新的重要抗性来源材料。

山丹由于其良好的观赏和药用价值，近年来野生资源被大量采挖，加之自然更新能力较弱，种群破坏严重，一些地区山丹已濒临灭绝。山丹由于其鳞茎小、繁育难度大、原生环境复杂多样，并且病毒感染率极高，使得种源开发和资源异地保存举步维艰。组织培养技术作为山丹资源保存和后续种源产业化开发唯一有效的途径逐渐受到人们的重视，但传统组织培养通常需要大量采挖山丹地下鳞茎作为外植体，而山丹鳞茎生长的土壤中存在大量的微生物，以鳞片为外植体时，由于携带大量真菌或细菌，在进行初代培养时污染率极高，成功率很低，并且大量采挖山丹鳞茎作为外植体，会加剧对野生山丹资源的破坏。同时，以鳞片为外植体获得的再生后代不能脱除病毒，随着繁殖世代增加，病毒不断积累，给山丹资源保护和后续种源开发带来毁灭性影响。

前人研究表明，植物种子一般是不携带病毒的，那么作为未成熟种子的胚珠也可以确定是没有感染病毒的。

基于上述现状，开发简单易行、并且对野生资源不造成破坏的山丹脱毒组培技术势在必行。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高效、低污染率的山丹脱毒快繁方法，本发明运用胚培养技术，以山丹授粉后充分膨大但尚未成熟的蒴果为材料，剥取蒴果内的胚珠（未成熟的种子），选择合适的培养基直接诱导形成初代无毒山丹试管苗。初代无毒山丹试管苗接种到合适的扩繁培养基上进行增殖。增殖后的试管苗转接到附加特定生长素的改良的MS培养基，在特定光周期下培育成重量不低于1g的大规格山丹试管生鳞茎。

本发明提供的技术方案具体如下：

一种山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：

步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；

步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；

步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基MS+NAA上，促进萌发培养基MS+NAA为MS+40-60g/L蔗糖+0.01-0.1mg/L NAA+ 6.5-7.0g/L琼脂粉，pH 5.4-5.6；高温条件下高压灭菌15-20分钟；

所有山丹试管苗均由胚珠中幼胚直接发育而来，不经愈伤组织和不定芽阶段，直接形成实生苗；