[发明专利]一种山丹脱毒快繁方法

权利要求书

1.一种山丹脱毒快繁方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；

步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；

步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基MS+NAA上，促进萌发培养基MS+NAA为MS+40-60g/L蔗糖+0.01-0.1mg/L NAA+ 6.5-7.0g/L琼脂粉，pH 5.4-5.6；高温条件下高压灭菌15-20分钟；

步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，根据黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用RT-PCR对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明脱毒；

步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基MS+KT+NAA，扩繁培养基MS+KT+NAA为MS+20-40g/L蔗糖+1.0-3.0mg/L KT+0.2-1mg/L NAA+ 6.5-7.0g/L琼脂粉，pH5.7-6.0；

步骤（6）、试管鳞茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基；鳞茎膨大及生根培养基为改良MS培养基附加蔗糖40-50g/L、甘露醇20-30g/L和IAA0.3-1mg/L；

改良MS培养基成分及含量如表1所示：

表1改良MS培养基成分及含量表

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2.根据权利要求1所述的山丹脱毒快繁方法，其特征在于：步骤（2）中，用0.2-0.5%的洗洁精水浸泡10-20分钟，自来水流水冲洗半小时以上；然后置于超净工作台上，先用浓度70-75%酒精浸泡60-100秒，并不断晃动，再用浓度1.5-2.5%的次氯酸钠溶液浸泡15-30分钟，期间不断晃动，最后用无菌水冲洗4-6次，每次不少于5分钟。

3.根据权利要求1所述的山丹脱毒快繁方法，其特征在于：步骤（3）中，胚珠培养条件为：在温度25±1°C，光强12-20μmol·m^-2 ·s^-1条件下培养，每天10-16小时光照，8-14小时黑暗。

4.根据权利要求1所述的山丹脱毒快繁方法，其特征在于：步骤（5）中，培养条件为：在温度25±1°C，光强30-36μmol·m^-2 ·s^-1条件下培养，每天10-16小时光照，8-14小时黑暗。