[发明专利]一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法

摘要

本发明提供了一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，该方法的技术流程包括：（1）铁皮石斛植株预处理；（2）无菌材料的获得；（3）外植体接种与诱导培养；（4）种质慢生长保存；（5）种种质复壮增殖；（6）水培壮苗生根；（7）炼苗与移栽。本发明通过对铁皮石斛组培条件的有效调控，并采用两种不同的培养基交替继代，有效减缓了保存材料的生长繁殖，延长了继代间隔时间，减少了继代次数，从而在降低保存成本的同时减少可能的遗传变异；本发明的方法操作简便，稳定可靠，可以保存种质长达长4‑5年，并且种质恢复生长效果良好，可以在较短时间内增殖扩繁，为铁皮石斛种质资源的开发利用提供了技术支持。

主权项

1.一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：（1）铁皮石斛植株预处理选择生长健壮、无病虫害的铁皮石斛植株，取材后进行根部清洗，然后将根部浸入预处理液中，在8‑10℃黑暗环境下预培养5‑7d；（2）无菌材料的获得选择铁皮石斛幼嫩的带节茎段，小心摘除叶片，用肥皂水或洗洁精轻轻洗涤，在自来水下冲洗干净；然后置于超净工作台上，先用70%异丙醇浸泡1min，无菌蒸馏水冲洗3‑4次，再用2.0%的戊二醛加3滴吐温80消毒8‑10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3‑4次，用滤纸吸干表面水分后备用；（3）外植体接种与诱导培养将上述消毒后外植体切成长1.0‑1.5cm的小茎段，每段包含一个节间，再将其水平接种于芽诱导培养基上，培养38‑44d诱导出丛生的不定芽；培养条件控制为温度25‑27℃、光照强度1400‑1600lx、光周期10‑12h光/12‑14h暗；（4）种质慢生长保存待诱导的不定芽长至2.0‑3.0cm高时，将其从瓶中取出，切成单株并转接到继代培养基①或继代培养基②上，先置于温度15‑18℃、光照强度800‑1200lx、每天光照10‑12h的条件下培养15d，然后置于低温、弱光的培养条件下使其缓慢生长，每14个月继代一次，2种继代培养基交替使用，然后继续进行慢生长保存；（5）种质复壮增殖铁皮石斛种质保存期结束后，将慢生长保存的不定芽转接到复壮培养基上，置于温度23‑27℃、光照强度1800‑2200lx、每天光照12h的条件下恢复生长，每28d左右继代1次，继代2‑3次可获得增殖的长势旺盛的铁皮石斛丛生芽；（6）水培壮苗生根将上述丛生芽每个单独切下转接到壮苗生根培养液中，置于温度23‑27℃、光照强度1800‑2200lx、每天光照12‑16h的条件下培养25‑30d获得生长健壮的铁皮石斛组培苗；（7）炼苗与移栽当组培苗根系长至6‑8条，真叶5‑6片时，将组培苗移至大棚中，在室温、半遮光条件下打开瓶口炼苗5‑7d；然后将组培苗从瓶内取出，将根部在30%乙蒜素乳油500倍稀释液中浸泡15min后，移栽入装有栽培基质的穴盘中，此时大棚内温度控制在20‑28℃，湿度65‑85%，遮光度70‑80%，进行常规栽培管理。