[发明专利]一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法

说明书

本发明提供了一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，该方法的技术流程包括：（1）铁皮石斛植株预处理；（2）无菌材料的获得；（3）外植体接种与诱导培养；（4）种质慢生长保存；（5）种种质复壮增殖；（6）水培壮苗生根；（7）炼苗与移栽。本发明通过对铁皮石斛组培条件的有效调控，并采用两种不同的培养基交替继代，有效减缓了保存材料的生长繁殖，延长了继代间隔时间，减少了继代次数，从而在降低保存成本的同时减少可能的遗传变异；本发明的方法操作简便，稳定可靠，可以保存种质长达长4‑5年，并且种质恢复生长效果良好，可以在较短时间内增殖扩繁，为铁皮石斛种质资源的开发利用提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，属于药用植物组织培养和种质保存技术领域。

背景技术

石斛属是兰科中的第二大属，为多年生草本植物。该属植物主要分布在亚洲热带、亚热带和大洋洲等地区，全球共有大约1500余种。目前中国有74种2变种，多分布于秦岭以南的省份，主要分布于安徽、江西、浙江、福建、四川、广西和云南等地，其中以云南的产量最大。石斛属植物和其它兰科植物一样，大多数为附生，并且对生态环境要求十分严格；喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒，适宜在凉爽、湿润、空气畅通的环境生长，适宜生长温度为15-28度，适宜生长空气湿度为60%以上，对土肥要求不甚严格，野生多在疏松且厚的树皮或树干上生长，有的也生长于石缝中。由于石斛属植物集药用和观赏于一体，加上过度采挖利用，繁殖率低和生长缓慢等特点，该属的所有植物均被列入国家一级保护植物名录。

铁皮石斛，因其表皮颜色呈铁绿色而得名，又名铁吊兰、黑节草等，是石斛类植物中最为名贵、利用价值最高的一个品种，堪称石斛中的极品。铁皮石斛是我国传统名贵中药材，享有“药中黄金”之美誉，历代本草均有记载。《神农本草经》将铁皮石斛列为“上品”，道藏将其列为“中华九大仙草”之首，民间称其为“救命仙草”。其味甘，性微寒，归胃经、肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。现代药理学研究表明，铁皮石斛的药效成分主要有石斛多糖、氨基酸、黄酮、生物碱及微量元素等，在调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血糖、降血压、降血脂、保肝、护胃、抗辐射、护肤、保湿、促进毛发生长等方面均能起到一定的有益作用，是现代都市亚健康人群增强机体免疫力、缓解疲劳、促进消化、降低血糖的首选药材，具有广阔的市场前景和经济价值。

铁皮石斛种子极小，每个蒴果约有 2 万粒，在自然条件下，铁皮石斛种子需要依靠特定真菌诱导才能萌发，导致其自然繁殖率极低；加之，铁皮石斛对生长环境的独特要求，野生铁皮石斛生长缓慢，无法满足药用需求。此外，由于生态破坏与过度开采，野生铁皮石斛资源已濒临枯竭。近年来，用组织培养方法快速大量繁殖试管苗，以提高繁殖系数，短时期内提供大量的种苗，是解决铁皮石解资源短缺的有效途径。目前规模化组培生产铁皮石斛应用最早和最广泛的外植体是无菌种子，即在离体培养条件下，种子萌发后形成原球茎，原球茎可以直接发育形成幼苗，也可以诱导原球茎产生大量愈伤组织，由愈伤组织再分化发育成幼苗。但是为了实现铁皮石斛的快速繁殖，生产企业往往使用原球茎频繁继代，容易导致体细胞无性系变异，从而使保存的原始种质丢失，据报道生产企业平均每3年就要更换种源重新扩繁。因此，在组织培养技术建立无性繁殖体系的基础上，开展种质离体保存研究，使珍贵的野生资源和人工栽培的优良种质得到保存，十分必要。

种质离体保存方法按保存时间可以分为短期、中长期和长期保存三种。目前在铁皮石斛种质资源的短期保存方面，已经取得了显著进展，利用常规组织培养方法一般可以保存种质材料1年以内，如果保存时间过长可能会由于继代次数过多造成变异和种性退化；在长期保存方面，一般采用液氮超低温保存法，但此方法技术设备要求较高，目前尚处于试验阶段。因此本发明团队在铁皮石斛的慢生长种质保存方面进行了深入研究，通过一系列技术措施，限制种质材料生长，延长继代时间，减少种质变异，以期为实现铁皮石斛种质资源的中长期保存提供科学理论和实践依据。

发明内容