[发明专利]一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法

权利要求书

1.一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：

（1）铁皮石斛植株预处理

选择生长健壮、无病虫害的铁皮石斛植株，取材后进行根部清洗，然后将根部浸入预处理液中，在8-10℃黑暗环境下预培养5-7d；

（2）无菌材料的获得

选择铁皮石斛幼嫩的带节茎段，小心摘除叶片，用肥皂水或洗洁精轻轻洗涤，在自来水下冲洗干净；然后置于超净工作台上，先用70%异丙醇浸泡1min，无菌蒸馏水冲洗3-4次，再用2.0%的戊二醛加3滴吐温80消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3-4次，用滤纸吸干表面水分后备用；

（3）外植体接种与诱导培养

将上述消毒后外植体切成长1.0-1.5cm的小茎段，每段包含一个节间，再将其水平接种于芽诱导培养基上，培养38-44d诱导出丛生的不定芽；培养条件控制为温度25-27℃、光照强度1400-1600lx、光周期10-12h光/12-14h暗；

（4）种质慢生长保存

待诱导的不定芽长至2.0-3.0cm高时，将其从瓶中取出，切成单株并转接到继代培养基①或继代培养基②上，先置于温度15-18℃、光照强度800-1200lx、每天光照10-12h的条件下培养15d，然后置于低温、弱光的培养条件下使其缓慢生长，每14个月继代一次，2种继代培养基交替使用，然后继续进行慢生长保存；

（5）种质复壮增殖

铁皮石斛种质保存期结束后，将慢生长保存的不定芽转接到复壮培养基上，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12h的条件下恢复生长，每28d左右继代1次，继代2-3次可获得增殖的长势旺盛的铁皮石斛丛生芽；

（6）水培壮苗生根

将上述丛生芽每个单独切下转接到壮苗生根培养液中，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12-16h的条件下培养25-30d获得生长健壮的铁皮石斛组培苗；

（7）炼苗与移栽

当组培苗根系长至6-8条，真叶5-6片时，将组培苗移至大棚中，在室温、半遮光条件下打开瓶口炼苗5-7d；然后将组培苗从瓶内取出，将根部在30%乙蒜素乳油500倍稀释液中浸泡15min后，移栽入装有栽培基质的穴盘中，此时大棚内温度控制在20-28℃，湿度65-85%，遮光度70-80%，进行常规栽培管理。

2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述铁皮石斛的品种为“森山2号”。

3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述步骤（1）中预处理液的配方为：康多酚3.5mg/L，乙二醇缩糠醛1.1 mg/L，维生素C 0.8 mg/L，茉莉酸甲酯1.0 mg/L，花宝1号0.5g/L。

4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述步骤（3）中芽诱导培养基的配方为：1/2MS+1.8mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.05mg/L三十烷醇+硝酸铈0.5mg/L，pH 值为5.3~5.7。

5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛的种质资源离体保存方法，其特征在于，所述步骤（4）中低温、弱光的培养条件为温度5-7℃、光照强度500-800lx、光照周期为12h光/12h暗。