[发明专利]小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法

摘要

本发明涉及小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法，其包括如下步骤：（1）获得小麦HsfA2亚族基因的PCR产物；（2）对载体pYES2进行酶切，得到线性化载体，进行重组反应；（3）反应产物转化大肠杆菌；（4）序列测定；（5）将测序正确的重组载体转化酵母，培养；（6）重组载体和空载体转化酵母细胞INVSc1，筛选阳性酵母克隆；（7）培养，在OD₆₀₀值达到0.4‑0.8之间，除去培养基；（8）梯度稀释到OD₆₀₀为0.1、0.05和0.01，一组作为对照，另一组进行热激处理，吸取8µL，30℃恒温培养箱生长2‑3天，观察并拍照鉴定。本发明稳定性高、准确性好。

主权项

1.小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）利用重组反应系统设计扩增小麦HsfA2亚族基因特异引物对，利用高保真PCR聚合酶扩增，获得小麦HsfA2亚族基因的PCR产物；（2）利用限制性内切酶 Kpn I和EcoR I对载体pYES2进行酶切，电泳后回收得到线性化载体，将PCR产物与线性化载体按1∶2的摩尔比混合，利用 ClonExpress II快速克隆技术进行重组反应；（3）利用热激法将反应产物直接转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞，37℃倒置培养过夜；（4）将单个菌落挑至100 µL新鲜的LB培养基中，混匀，取2 µL作为模板进行PCR 扩增，根据电泳条带大小选择正确的克隆进行序列测定；（5）将测序正确的重组载体转化酵母 INVSc1感受态细胞，然后将细胞均匀涂抹在 SC‑Glu‑Ura‑筛选平板上，30℃培养 2~3 d；（6）采用菌落 PCR 方法鉴定阳性克隆，分别以重组载体和空载体转化酵母细胞 INVSc1，筛选阳性酵母克隆；（7）分别挑选2个菌株的阳性克隆，在SC‑Glu‑Ura‑液体培养基震荡，250rpm，培养过夜，检测OD600值，用SC‑Gal‑Ura‑液体培养基将酵母菌液稀释到OD600至0.2，重新震荡，200rpm，培养2‑3 h，在OD600值达到0.4‑0.8之间即酵母指数生长期，离心收集菌体，无菌水洗涤两遍，除去培养基；（8）梯度稀释到0.1、0.05和0.01共3个OD600值，分成2组，一组作为对照，另一组置于50℃水浴中热激处理45 min，吸取8µL，分别点在加入半乳糖的SC‑Gal‑Ura‑固体培养基上，30℃恒温培养箱生长2‑3天，观察并拍照；（9）观察酵母细胞生长势及生长速率来鉴定酵母细胞是否具有耐热性。