[发明专利]小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法

权利要求书

1.小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）利用重组反应系统设计扩增小麦HsfA2亚族基因特异引物对，利用高保真PCR聚合酶扩增，获得小麦HsfA2亚族基因的PCR产物；

（2）利用限制性内切酶 Kpn I和EcoR I对载体pYES2进行酶切，电泳后回收得到线性化载体，将PCR产物与线性化载体按1∶2的摩尔比混合，利用 ClonExpress II快速克隆技术进行重组反应；

（3）利用热激法将反应产物直接转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞，37℃倒置培养过夜；

（4）将单个菌落挑至100 µL新鲜的LB培养基中，混匀，取2 µL作为模板进行PCR 扩增，根据电泳条带大小选择正确的克隆进行序列测定；

（5）将测序正确的重组载体转化酵母 INVSc1感受态细胞，然后将细胞均匀涂抹在 SC-Glu-Ura-筛选平板上，30℃培养 2~3 d；

（6）采用菌落 PCR 方法鉴定阳性克隆，分别以重组载体和空载体转化酵母细胞INVSc1，筛选阳性酵母克隆；

（7）分别挑选2个菌株的阳性克隆，在SC-Glu-Ura-液体培养基震荡，250rpm，培养过夜，检测OD₆₀₀值，用SC-Gal-Ura-液体培养基将酵母菌液稀释到OD₆₀₀至0.2，重新震荡，200rpm，培养2-3 h，在OD₆₀₀值达到0.4-0.8之间即酵母指数生长期，离心收集菌体，无菌水洗涤两遍，除去培养基；

（8）梯度稀释到0.1、0.05和0.01共3个OD₆₀₀值，分成2组，一组作为对照，另一组置于50℃水浴中热激处理45 min，吸取8µL，分别点在加入半乳糖的SC-Gal-Ura-固体培养基上，30℃恒温培养箱生长2-3天，观察并拍照；

（9）观察酵母细胞生长势及生长速率来鉴定酵母细胞是否具有耐热性。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤（2）中的重组反应为：于冰水浴中配制反应体系，含4 µL 5× ClonExpress II buffer，50~200 ng 线性化载体，20~200 ng插入片段扩增产物，2 µL Exnase II，加无菌水至总体积2 µL，混匀各组分后，于 37℃反应30 min，之后立即置冰浴中冷却5 min。

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述小麦HsfA2基因为TaHsfA2e时，所述步骤（1）中的特异引物对包括前引物和后引物，所述前引物的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述后引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述重组反应系统为ClonExpress II重组反应系统。