[发明专利]小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法

说明书

本发明涉及小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法，其包括如下步骤：（1）获得小麦HsfA2亚族基因的PCR产物；（2）对载体pYES2进行酶切，得到线性化载体，进行重组反应；（3）反应产物转化大肠杆菌；（4）序列测定；（5）将测序正确的重组载体转化酵母，培养；（6）重组载体和空载体转化酵母细胞INVSc1，筛选阳性酵母克隆；（7）培养，在OD₆₀₀值达到0.4‑0.8之间，除去培养基；（8）梯度稀释到OD₆₀₀为0.1、0.05和0.01，一组作为对照，另一组进行热激处理，吸取8µL，30℃恒温培养箱生长2‑3天，观察并拍照鉴定。本发明稳定性高、准确性好。

技术领域

本发明属于通过转基因酵母进行基因功能鉴定相关技术领域。具体为遗传转化小麦A2亚族热激转录因子基因的酵母细胞耐热性的鉴定方法。

背景技术

随着全球温室效应的加剧,全球气候变暖已经成为现代农业生产体系所面临的严峻挑战。小麦作为世界范围内一种重要的作物，其产量越来越受到全球变暖的不利影响，我国温带小麦在生育期间经常遭受干热风危害，导致小麦产量和品质均不同程度降低，一般年份造成小麦减产5-10%，偏重年份达 30%。因此，提高小麦耐热性，创制小麦耐热新种质、培育耐热性强的品种是降低高温胁迫危害的关键。现代分子生物学和基因工程相关技术的发展，使人们在分子水平上揭示植物对高温胁迫响应和诱导相关信号传导途径成为可能，同时为通过基因工程手段提高作物耐热胁迫能力成为现实。而解析小麦高温胁迫响应的分子机制、挖掘优质的抗逆基因是关键。

由于植物的不可移动性，导致其会持续的暴露在热胁迫环境当中。为了适应这种长期的胁迫环境，植物进化出一套应对胁迫的响应网络。热激转录因子（Hsf）是热胁迫传导链的末端调控元件，能够通过激活热胁迫和其它胁迫响应基因的表达从而提高植物耐热性，是优异的作物品种改良基因资源。

自酵母Hsf首先被发现以来，模式植物拟南芥和番茄Hsf家族得以重点研究，近年来，多种作物的Hsf家族基因被生物信息学推测和报道。不同作物家族基因数量不等，拟南芥和番茄分别有21个和24个Hsfs，大田作物Hsf家族基因数目多，玉米有30个，小麦热激转录因子家族至少有56个小麦Hsfs被识别。研究表明，Hsf家族包括A、B和C家族，不同家族细分多个亚族，每个亚族又包括不同的基因成员。A2亚族基因不仅参与植株基础耐热性调控，与植物的获得耐热性密切相关，在热胁迫后期及恢复阶段起重要的调控作用。

因此，在HsfA2基因克隆和特性研究的基础上进行多方面功能鉴定，是功能基因研究的重要环节，前人对耐热基因研究相对较少，基因的耐热性鉴定缺乏成熟的技术体系。加之，热胁迫处理受多种外界因素影响，稳定性差，鉴定结果的准确性差。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定性和准确性好的小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法。

本发明采用如下技术方案：

小麦HsfA2亚族基因在酵母中耐热性的鉴定方法，其包括如下步骤：

（1）利用重组反应系统设计扩增小麦HsfA2亚族基因特异引物对，利用高保真PCR聚合酶扩增，获得小麦HsfA2亚族基因的PCR产物；

（2）利用限制性内切酶Kpn I和EcoR I对载体pYES2进行酶切，电泳后回收得到线性化载体，将PCR产物与线性化载体按1∶2的摩尔比混合，利用 ClonExpress II快速克隆技术进行重组反应；

（3）利用热激法将反应产物直接转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞，37℃倒置培养过夜；