[发明专利]一种大规模生产慢病毒的方法

摘要

本发明公开了一种大规模生产慢病毒的方法，包括以下步骤：步骤一、细胞培养；步骤二、细胞培养袋培养；步骤三、慢病毒大规模扩增；步骤四、纯化；其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养；细胞培养袋培养条件为温度37℃，溶氧设置为60％，PH7.1，摇摆速度10‑20rpm，摇床角度7‑9°。本发明通过改善细胞生长环境，减少通气时对细胞的伤害，增加溶氧效果，减小机械剪切力对细胞的损伤，提高细胞的生长密度，从而提高细胞的总产量，进而提高慢病毒的产量。

主权项

1.一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、细胞培养：将冻存细胞复苏、培养、传代；步骤二、细胞培养袋培养：将步骤一中所述传代后的细胞，以2‑9E+5个/ml的接种密度及1.5L的工作体积接种到4L的细胞培养袋中，并采用灌注培养；当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6‑12g时，接种慢病毒；步骤三、慢病毒大规模扩增：1)转染前1h，将细胞培养袋内的细胞培养基更换为无血清DMEM培养基；2)用无血清DMEM培养基稀释质粒，混匀，记为A液；用相等体积的Opti‑MEM培养基稀释PEI，混匀，记为B液；室温静止5min后，将B液缓慢加到A液中并混匀，然后室温放置20min，得DNA‑PEI混合液；其中，质粒：PEI＝1：2，W/W；3)将2)中的DNA‑PEI混合液缓慢加入到1)中的细胞培养袋中，10rpm轻轻混匀20min后，摇床停止摆动；转染4h后灌注10％胎牛血清DMEM培养基，摇摆开始摇动，摆速10rpm，温度37℃；转染36h后开始灌注无血清培养基；每天细胞培养袋内取样测糖浓度和病毒颗粒数，收获液取样测病毒颗粒数，当病毒颗粒数小于5E+5TU时，停止收获；步骤四、纯化：将步骤三中收获的慢病毒原液通过离心、超滤、核酸水解、凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的纯化液进行检测并保存；其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气；细胞培养袋培养条件为温度37℃，PH7‑7.2，摇摆速度10‑20rpm，摇床角度7‑9°。