[发明专利]一种大规模生产慢病毒的方法

权利要求书

1.一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、细胞培养：将冻存细胞复苏、培养、传代；

步骤二、细胞培养袋培养：将步骤一中所述传代后的细胞，以2-9E+5个/ml的接种密度及1.5L的工作体积接种到4L的细胞培养袋中，并采用灌注培养；当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6-12g时，接种慢病毒；

步骤三、慢病毒大规模扩增：

1)转染前1h，将细胞培养袋内的细胞培养基更换为无血清DMEM培养基；

2)用无血清DMEM培养基稀释质粒，混匀，记为A液；用相等体积的Opti-MEM培养基稀释PEI，混匀，记为B液；室温静止5min后，将B液缓慢加到A液中并混匀，然后室温放置20min，得DNA-PEI混合液；其中，质粒：PEI＝1：2，W/W；

3)将2)中的DNA-PEI混合液缓慢加入到1)中的细胞培养袋中，10rpm轻轻混匀20min后，摇床停止摆动；转染4h后灌注10％胎牛血清DMEM培养基，摇摆开始摇动，摆速10rpm，温度37℃；转染36h后开始灌注无血清培养基；每天细胞培养袋内取样测糖浓度和病毒颗粒数，收获液取样测病毒颗粒数，当病毒颗粒数小于5E+5TU时，停止收获；

步骤四、纯化：将步骤三中收获的慢病毒原液通过离心、超滤、核酸水解、凝胶过滤层析进行分离纯化，得到的纯化液进行检测并保存；

其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养，且对细胞培养袋内同时进行上部和底部通气；细胞培养袋培养条件为温度37℃，PH7-7.2，摇摆速度10-20rpm，摇床角度7-9°；步骤二和步骤三中的细胞培养袋内均设有片状载体和隔膜，所述隔膜将细胞培养袋分隔成上下两部分，所述片状载体填充在细胞培养袋的下部，且所述隔膜的孔隙使细胞通过而阻止片状载体通过。

2.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，步骤二中，当细胞培养袋内的细胞日耗糖为6-11g时，接种慢病毒。

3.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，所述片状载体的填充密度均为10-40g/L。

4.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，所述细胞培养袋的上方中间处设有进气口和排气口，所述细胞培养袋上方侧边还设有进液口和出液口。

5.根据权利要求4所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，所述细胞培养袋的进气口包括上进气口和下进气口，上进气口设置在细胞培养袋的上部，所述下进气口设置在细胞培养袋的底部。

6.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，所述细胞培养袋下方还设有溶氧电极和PH电极。

7.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，所述细胞为HEK293t细胞。

8.根据权利要求1所述的一种大规模生产慢病毒的方法，其特征在于，步骤二中细胞在填充有片状载体的4L细胞培养袋中培养：

1)设备：三气控制器、细胞培养袋、摇床和恒温箱；

2)接种细胞：接种密度2-9E+5个/ml，工作体积1.5L；

3)接种参数：温度37℃，摇摆速度10-20rpm，摇床角度7-9°，5％CO2的混合气体；

4)方法

a混匀：细胞接种到细胞培养袋时，细胞培养袋内浑浊，显微镜下观察到大量未贴壁细胞，将袋子放摇床上，通5％CO2的混合气体,摇摆转速20rpm，温度37℃，混匀15-25分钟；

b细胞贴壁：静置培养30min-2h后，观察细胞培养袋内液体澄清度，直到液体澄清，细胞贴壁；

c细胞培养：摇摆速度10-20rpm，温度37℃，摇床角度7-9°，5％CO2的混合气体；次日开始，每日2次取样测糖，统计结果；

d当糖浓度低于1.4g/L时，开始灌加培养。