[发明专利]一种大规模生产慢病毒的方法

说明书

本发明公开了一种大规模生产慢病毒的方法，包括以下步骤：步骤一、细胞培养；步骤二、细胞培养袋培养；步骤三、慢病毒大规模扩增；步骤四、纯化；其中，步骤二和步骤三中的细胞培养袋均置于摇床中并于恒温箱培养；细胞培养袋培养条件为温度37℃，溶氧设置为60％，PH7.1，摇摆速度10‑20rpm，摇床角度7‑9°。本发明通过改善细胞生长环境，减少通气时对细胞的伤害，增加溶氧效果，减小机械剪切力对细胞的损伤，提高细胞的生长密度，从而提高细胞的总产量，进而提高慢病毒的产量。

技术领域

本发明涉及生产慢病毒的技术领域，具体的说是涉及一种大规模生产慢病毒的方法。

背景技术

慢病毒载体（LV）提供了许多有价值的特性，包括稳定的将基因整合到宿主基因组中，通过VSV-G假型分型将遗传信息转移到分裂和非分裂细胞以及广泛的组织趋向性能力。目前正在临床试验中用于治疗罕见和更频密的遗传和后天疾病，以及CAR-T细胞癌症治疗。慢病毒介导的基因治疗将会很快成为不仅是罕见遗传病，也会是血液肿瘤、HIV等感染性疾病的常规治疗方法。将会有大量的病人等待治疗，因此可扩大的慢病毒生产工艺的改进变得越来越迫切。这种迫切性不仅在研究机构和医院，而且也在工业化生产领域，该领域正朝着这种医疗产品快速前进。

慢病毒载体通常是通过多质粒瞬时转染HEK293t贴壁细胞株而产生，贴壁培养时细胞附着和生长的面积决定放大倍数。由于瞬时转染中过量的质粒和转染试剂的残留，会引起终产物的污染。通过高度强化的贴壁培养物，及一次性固定床生物反应器，已解决部分病毒放大培养。事实上，在治疗中应用的慢病毒载体，需要以可再生的方式生产足够数量的临床和商业品质的病毒。根据应用和疾病，每名患者需要1-40×10⁹个感染单位的载体，这不仅增加了经济压力，还需要开发高产量的生产工艺。慢病毒载体（LV）是基因和细胞治疗应用的关键工具，如何为临床应用提供足够数量的载体目前仍是一个难题，因此应促使该领域向更有利于大规模生产的培养发展。在本发明中，我们提出了一种生产慢病毒载体的技术，由于慢病毒载体的稳定性差，我们开发了一种在灌流模式下的生产工艺。

目前采用贴壁细胞大规模生产慢病毒工艺现状是大多数大规模生产都是小规模生产的直接放大，即通过增加培养/生产单元来实现。生产基本上采用大量的多层培养系统(Cell Factories(CF) (CF-10) (Figure 2))或者Cell Stacks(CS)。因为易于操作，10叠层装置(CS-10)是首选，虽然原则上40叠层装置同样也可以用，但是因为它重量增加的原因所以需要特殊的处理系统。此外，每层平板的气体交换及培养基层不可能一致，因此用显微镜控制40叠层装置细胞的生长很困难。生产要么采用放在层流工作台的开放模式，要么采用半封闭模式，后者对操作人员、环境及终产品的安全性更高。

病毒收获是通过简单的培养基置换完成的，在某些情况下，通过增加收获次数来提高最终慢病毒的质量。然而，在临床前及临床级大规模生产时，频繁收获是不现实的，在大多数时候只是收获1-3次，体积为1-3个工作体积；同时，对工业化生产来说，在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式，而且转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准方法，但是这个方法在扩大规模上受限。本发明在贴壁培养系统中，培养上清可以间隔一天收获两次，且可连续收获6个工作体积，这大大降低了成本、提高了效益。虽然灌注系统在大规模时复杂且成本高，但对瞬时转染具有巨大吸引力，灌注系统可以在保持质粒用量不变的情况下，将收获体积扩大致数倍的工作体积。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种大规模生产慢病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种大规模生产慢病毒的方法，包括以下步骤：

步骤一、细胞培养：将冻存细胞复苏、培养、传代；