[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法

摘要

本发明涉及兽用生物制品技术领域，提供了一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，包括如下步骤：细胞复苏及扩增，片状载体处理，悬浮培养罐及片状载体灭菌，细胞上罐，细胞悬浮培养，含毒维持液配制，接毒，收毒。本发明的优点在于：本发明使用片状载体悬浮培养，劳动强度小、工艺简单、培养条件佳、成本低，通过片状载体悬浮培养出的细胞量非常大，先加入含少量胰酶的维持液，使一部分先病变，再通过换液的办法，加入含新胰酶的维持液，再促使一部分病变，重复此方法使细胞逐渐病变，可实现多次收获，并且生产出抗原病毒含量是传统生产工艺的10‑30倍。

主权项

1.一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)细胞复苏及扩增将冻存的Vero细胞复苏到T75细胞培养瓶中，并置于36‑37℃温度下培养，长至单层致密后，用含0.25％胰酶的细胞分散液消化后，再加入含8‑10％新生牛血清的DMEM细胞生长液传代培养，按1:(3‑6)的比例逐级传代放大至3‑15L转瓶内培养，转瓶按照1:(3‑5)的传代比例扩传；(2)片状载体处理按照20‑40g/L片状载体的比例，称量好所需的片状载体放入7‑50L悬浮培养罐的载体框内，组装好悬浮培养罐，打入PBS缓冲液，使之充分浸泡到片状载体，10‑15min后弃去PBS缓冲液，加入新的PBS缓冲液，并使其超过片状载体上界面10‑15cm；(3)悬浮培养罐及片状载体灭菌按照悬浮培养的常规操作规程，对步骤(2)中含片状载体的7‑50L悬浮培养罐进行121℃高温灭菌40‑50min，冷却后取样做无菌检验；(4)细胞上罐将步骤(1)中3‑15L转瓶内的Vero细胞消化下来，按终浓度(1‑5)×106cells/mL的接种密度接种到步骤(3)中的7‑50L悬浮培养罐内，设定温度37℃、pH 7.0‑7.2、DO 30％‑60％、转速50‑100rpm，开始培养；(5)细胞悬浮培养开始培养后22‑26h，取样测定培养液的含糖量，当含糖量低于8mmoL/L时，开始灌流培养；(6)含毒维持液配制取调好pH 7.0‑7.4并预热的DMEM溶液，加入胰酶和猪流行性腹泻病毒PEDV毒种，使最终含胰酶5‑10μg/mL、猪流行性腹泻病毒PEDV毒种1％‑5％，混合均匀后，置于常温待用；(7)接毒当悬浮培养罐Vero细胞培养到72‑96h时，停止培养，将生长液弃去，通过管道加入事先预热的PBS溶液，搅拌1‑5min，弃去，再加入PBS搅拌1‑5min，如此洗3‑5次；然后再加入步骤(6)配制的含毒维持液，设定温度37℃、pH 7.2‑7.4、DO 30％‑60％、转速50‑100rpm，开始病毒悬浮培养；(8)收毒A.当病毒悬浮培养至16‑24h，进行第一次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％‑90％，放‑15℃以下冷库保存；B.在一次收毒后的余下病毒悬浮培养液中加入含5‑10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16‑24h，进行第二次收获病毒液，收获体积为培养总体积的80％‑90％，放‑15℃以下冷库保存；C.在二次收毒后的余下病毒悬浮培养液中再加入含5‑10μg/mL胰酶的DMEM溶液继续培养16‑24h，进行第三次收获病毒液，全部收完，放‑15℃以下冷库保存；其中，每个收次的病毒液，均测定一次病毒含量。